一、Exosome簡介

       最近幾年，一種叫做Exosome的小囊泡正受到大家廣泛的關注。Exosome是直徑約為30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1的小囊泡。Exosome天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌體(Exosome) 是活細胞分泌的來源于晚期核內體(也稱為多囊泡體 )的膜性囊泡。

       Exosome在30年前被人們所發現。早期的研究認為，exosome執行蛋白運輸功能，特異靶定受體細胞，交換蛋白和脂類或引發下游信號事件。直到2007年，研究人員發現exosome也運輸核酸，參與細胞間通訊。總之，其蛋白、RNA和脂肪成分特異，且攜帶了一些重要的信號分子，有望在多種疾病的早期診斷中發揮作用，這使得exosome的市場也在快速擴展，并成為熱門的研究對象。

      不同組織細胞來源exosome由于攜帶的蛋白質不同，而能夠發揮不同的生物學功能。例如，腫瘤細胞分泌的exosome能夠介導血管再生腫瘤細胞增殖及免疫逃逸；而樹突狀細胞源性exosome則能夠引起機體有效的抗腫瘤免疫應答。目前研究發現，Exosome內含有與細胞來源相關的蛋白質rRNA和microRNA，并且exosome能夠通過生物屏障，在細胞間傳遞功能性核酸分子，從而發揮各種生物學功能，故exosome有望成為一種新型給藥途徑及基因治療載體。

      Exosome攜帶蛋白質包括源細胞非特異性和源細胞特異性兩類蛋白分子。前者可能與exosome的生物發生和生物學作用有關 ，主要包括：細胞溶質蛋白、參與細胞內信號轉導的蛋白、各種代謝酶、熱休克蛋白和四跨膜蛋白；另一類是特殊蛋白質，這類蛋白質只存在于某種特殊的細胞分泌 的exosome，而這些特定細胞源的exosome與其生物學功能有著密切聯系，例如分子來源的Exosome上含有MHCII類分子。

二、Exosome提取

      Exosome是由活細胞分泌的，它是一種亞細胞成分，組要成分是磷脂雙分子和攜帶的膜性分子，其界定依據形態學和生物化學及提取方式不同細胞源的exosome是不同的，這些不同的理化性質有利于exosome的提取。從體外培養的細胞中分離和提取exosome的主要方法是高速離心法，這種方法能分離出大的碎片和已經死亡細胞， 然后再通過超速離心法分離 提取exosome 最后利用糖梯度，使脂質囊性質的exosome漂浮于上面。

      具體來說，exosome的研究方式是分離/捕獲小囊泡，并拷問它所攜帶的貨物。就目前而言，人們多采用超速離心、磁珠免疫捕獲、沉淀或過濾的方法，對exosome進行前期的分離。之后利用電鏡來分析其大小和形態，利用流式細胞儀來分析細胞表面標記，通過Western blot和ELISA等方法對蛋白進行分析，或通過qPCR和新一代測序（NGS）來分析RNA。

      調查發現，在分離exosome時，約有56%的人采用超速離心法，說明這種方法仍是目前的金標準方法。不過，生物通之前也介紹過，這種方法缺點也不少：耗時耗力，往往需要8-30個小時；每次最多只能處理6個樣品；需要大量的起始材料；產量不高。商業化的exosome提取試劑盒已經上市，更為簡單省事。

1.超速離心法

       將欲提取的細胞培養上清液10ml，在4 ℃的環境下，300×g 10min ，2000×g 20min，棄沉淀，去除細胞；然后 l0,000×g 30min ，棄沉淀，去除亞細胞成分；再用10,000×g 60min，棄掉上清液，最后所得沉淀既為exosome ，用30ml PBS 溶液重新懸浮沉淀物，混勻后再以10,000×g 60min，用 l ml PBS溶液懸浮沉淀物提純的exosome 溶液分別裝入eppendorf 管內，置于-80℃冰箱內保存備用。

2.磁珠

      超速離心法既耗時又費力。現在您可以通過使用靈活可控的總外泌小體分離試劑，從不同的起始樣本中方便地富集完整的外泌小體。這些試劑及其配套的試驗方案完美適用于廣泛的實驗計劃，包括小輸入樣本量和多種樣本處理實驗。

      從培養細胞中富集的總外泌小體（使用總外泌小體分離試劑或超速離心）可以通過免疫磁性捕獲法進一步純化為亞組分。可使用基于Dynabeads?的CD63特異性試劑，或將鏈霉親和素試劑與特定的生物素化抗體結合使用，可基于表面抗原的免疫反應純化得到任何所需的亞組分。

三、Exosome分析

      在下游分析方面，分離純化出來的exosome可以做蛋白，也可以做RNA（microRNA和LncRNA），36%的研究人員通過Western blot或其他方法來鑒定蛋白，29%的人員利用qPCR對microRNA表達譜進行分析，9%利用芯片進行microRNA表達譜分析。同時，新一代測序的用戶也不少，13%的人員利用NGS開展microRNA/小RNA研究，9% 開展mRNA研究。此外，目前的大部分工作還是停留在科研階段，后續的生物標志物開發和驗證不多，而診斷和療法的開發就更少。Razvi認為，exosome的定性和定量研究是個快速發展的市場。同時，循環生物標志物的市場也存在著機遇和挑戰。不過，無創產前檢測技術的成功讓人們相信，循環生物標志物有望在腫瘤及其他疾病的診斷上發揮作用。

1.蛋白分析

（1）SDS-PAGE

通過SDS-PAGE電泳可以分析得到的Exosome中蛋白的含量及種類。

（2）Western-Blot

通過Western-Blot可以檢測Exosome中特定的蛋白表達情況。

（3）2-DE等蛋白組學分析

可以了解Exosome中不同蛋白的表達、數量情況

2. 透射電鏡

通過透射電鏡可以分析Exosome的大小、形態等，再結合免疫標記可以很清楚的分析特定指標在Exosome表達的部位。

3.基因水平

（1）Real-Time PCR

通過PCR可以分析需要研究的指標的表達量

（2）轉錄組分析

通過測序或者芯片，分析Exosome不同基因的轉錄水平

（3）miRNA 

通過測序或者芯片，檢測與Exosome相關的miRNA的表達情況，研究特定的miRNA

（4）lncRNA分析

通過測序或者芯片，檢測與Exosome相關的lncRNA的表達情況，研究特定的lncRNA與Exosome共同調控某種疾病的關系

四、Exosome中RNA的分離

1.切體隔離

增長切體無血清培養基的細胞。因此，任何血清細胞培養液中添加的外來應耗盡120萬個晚上XG離心在4 ° C后才能使用。

將細胞懸液錐形管。

在4 ° C沉淀細胞，離心10分鐘300 XG。

轉移上清超速離心機管，如果不徹底全面加入PBS。

樣品16 500 XG離心20分鐘，4 ° C至進一步去除細胞和細胞碎片。

通過0.2微米過濾除去大于200納米的顆粒過濾上清液。

過濾上清液轉移到新的超速離心機管和120 000 XG 70分鐘前，超速離心機密封管在4 ° C至顆粒的外來體。

棄上清。

最大的外切體檢索，懸浮切體充實ED顆粒多次在一個適當的緩沖體積小（?3 × 50μL）。這個緩沖區取決于以下的切體隔離計劃的下游實驗。例如，裂解液用于蛋白質和RNA的分離，PBS是用于電子顯微鏡和流式細胞儀和功能的研究介質可能是首選。

注;外來體也可以從不同的體液，如血漿，使用相同的過程，作為細胞培養基中分離。對于粘性液體，它可能是必要的，用PBS稀釋的樣品離心和過濾步驟之前的。在上述5點的離心速度，它可以增加至29 500 XG，第7點中的離心可以延長至90分鐘18。

如果樣品需要進一步純化的外切體顆粒可漂浮在蔗糖梯度和外來將主要分數representing一個密度1.13-1.19克/毫升2。

2.切體識別電子顯微鏡

為了進一步消除污染蛋白，重懸在120 000 XG 70分鐘，在4 ° C至重新沉淀外來的外切體的豐富沉淀，PBS和超速離心機。

的蛋白分離和總蛋白測定樣品的小等分。確保只有一小部分樣品裂解和蛋白質測量，并保存完整的外來體，解決的PBS，單獨的冰或在-80℃為進一步的實驗。

將在PBS重懸的完整的外來exosomal蛋白質約10微克，一個下降，一個封口膜。然后，用血管鉗，輕輕的位置上每一滴30-60分鐘的頂部formvar碳包覆鎳網格。保證網格定位涂層的一面面臨下降含外來。

將三滴，每30μL的PBS，在T他封口膜和洗網格，按順序定位的PBS液滴上的電網和使用吸油紙之間。使用吸油紙輕輕只是抱著它不涂面積接觸，密切合作，以電網側。

修復存款樣品的封口膜下降了2％多聚甲醛，并放置在頂部的10分鐘下降的網格。

重復洗滌步驟中的第4點，前一個合適的抗體免疫。常用的抗體是抗CD63和抗MHCⅡ類。電子顯微鏡也可以不免疫作為外來體的大小和形態上，完全可以識別基于。但是，我們建議，評估的大小，形態和為一個更確鑿的驗證的膜蛋白的存在。

網格傳輸選擇的主要抗體30μL下降，孵育40分鐘。洗凈重復第4點，但在PB中使用0.1％的牛血清白蛋白S代替的PBS單獨。

重復第7點，但與10納米金標記的第二抗體和單用PBS洗。

修復后下降了2.5％戊二醛中加入的封口膜樣品，孵育10分鐘下降頂部的網格。重復第4點的洗，但使用去離子水液滴，而不是三個水滴的PBS。

對比樣品加入下降2％醋酸鈾的封口膜，下降為15分鐘的頂部，并培育網格。

嵌入下降了0.13％甲基纖維素和0.4％的醋酸鈾的封口膜樣品，孵育10分鐘下降頂部的網格。

刪除多余的液體，然后輕輕地使用吸油紙的定位與涂邊格在一張紙上，讓空氣干燥5分鐘。

用電子顯微鏡檢查的籌備工作，或存儲在網格中的電網，為今后的工作。

3.由流式細胞儀的外切體的表征

作為外來太小，由目前的流式細胞儀設備檢測，有必要先綁定外來抗體包被的磁珠（ 圖1） 。這些珠子可以購買一個現成的產品，或選擇的抗體在實驗室。根據exosomal細胞來源，不同的抗體可以配上珠可以磁或乳膠字符。我們目前使用的抗MHC II類或抗CD63的包被的磁珠這種分析。

對于使用“國產”的抗體包被的磁珠，我們使用4微米乳膠具有抗CD63抗體包被的磁珠。 25μL4微米乳膠珠（30 × 10 6珠）100μL的MES緩沖的兩倍，3 000 XG 15-20分鐘，洗凈，在100μL的MES緩沖溶解沉淀。準備抗體的混合物，其中包含一個體積等于12.5微克抗體與相同體積的MES緩沖。添加珠抗體的混合物，在室溫下孵育過夜攪拌。抗體包被的磁珠洗凈，用PBS（3 000 20分鐘XG）三次沉淀溶于100μL存儲緩沖區（與終濃度為300 000珠/μL）。

對于每個樣本（每個抗體），繼續與卷等于30微克exosomal蛋白質的最低％?100 000抗體包被珠（PBS中解決了完整的外來）。

孵育外來珠，在一個總體積300μLPBS過夜，在4 ° C下輕柔的動作。

加入300μL200毫米甘氨酸和孵化30分鐘座。

兩次洗滌緩沖液的切體珠復合物（1-3％血清的PBS），10分鐘600 XG洗凈。

孵育50μLIgG抗體的外切體珠復合物4 ° C。在洗滌緩沖液洗凈切體珠復合物，在第5步中所述的兩倍。

添加90μL洗滌緩沖液和10μL抗體的選擇（理想的抗CD9，抗CD63或CD81的反）的切體珠復合物和40分鐘，輕柔的動作下孵育。在洗滌緩沖液的切體珠復合物在第5步中所述的兩次洗凈。

加入300μl洗滌緩沖液，并用流式細胞儀采集數據。

如上所述，不同的珠子可以使用，如協議或磁珠所述的乳膠珠。如果用來代替磁珠，請注意，該協議是略有不同。阻塞步驟（4點）是不是必需的，是由放置在一個磁性的立場，而不是一個離心管進行洗。

“自制”的抗體包被的磁珠使用的存儲緩沖區，包含0.1％甘氨酸和azid在PBS，pH值7.2，0.1％鈉。

更重要的是，確保使用流式細胞儀洗滌緩沖液（1-3％血清的PBS）外切體耗盡血清，以避免任何血清外來污染分析。

請注意，使用抗體加上珠的切體的表征時，重要的是要承認，這僅僅是一個特定的亞群，特定于所使用的抗體，即分離并鑒定。

4.切體檢測用Western blot

Western印跡是一個行之有效的方法，我們不會細講就方法本身，但重點放在一個合適的蛋白分離前的印跡和使用不同的抗體的重要性。

溶解蛋白裂解液的選擇外切體顆粒，并徹底吹打，旋渦混合。要進一步裂解的外來體，超聲水浴中3 × 5分鐘之間的旋渦混合樣品。最后，在室溫下5分鐘離心樣品13 000 XG，將上清轉移到一個新的Eppendorf管。

Measu重新選擇的方法總蛋白和負載20-50微克的蛋白質，每口井。

凝膠電泳和電泳分離和轉移的蛋白質。

座和洗膜，然后再執行對在外來豐富的蛋白質免疫。

檢測化學發光數字成像系統和分析軟件的特定蛋白質。

至于有沒有切體的特異性標志物，在外來豐富的蛋白質，從各個不同的細胞起源，是常用的外切體檢測。這些tetraspanins（如CD9，CD63和CD81），細胞骨架相關蛋白（如ezrin）和多泡的生物合成（如TSG101和ALIX）涉及的蛋白質，如蛋白質。其他蛋白質也常用于外來檢測Flotillin，HSC70和不同的Rab蛋白等，但也有特定的蛋白質，如A33（腸上皮細胞）的外來細胞中CD3（T細胞）和MHCⅡ類（抗原呈遞細胞）。因此，根據外來體是由什么類型的細胞進行檢測標記發布可能會有所不同。

由于其他車廂的細胞也能產生水泡，這是進一步建議，以確定這些車廂，如內質網（如calnexin和GRP78）和高爾基體（如GM130）的蛋白質的存在。因此，這些蛋白質的缺乏表示沒有或很少污染樣品中的其他車廂的囊泡研究。

5. exosomal RNA和RNA分析的分離

切體顆粒溶解在RNA裂解液的選擇和執行RNA的提取。根據下游實驗不同的RNA分離試劑盒可用于，但基于列的方法提供了更廣泛的RNA樣品。目前，我們正在使用由Exiqon miRCURY RNA分離試劑盒，但可能適合在SC上其他套件ientific問題就在眼前。

在進行RNA的分離是很重要的工作在無RNase的環境。因此，使用核酸和核酸免費槍頭和擦拭工作臺和設備，無污染物和核糖核酸酶。

RNA的提取，使用miRCURY RNA提取試劑盒，溶于350μL裂解液的切體顆粒，并執行旋渦混合15秒。

加入200μl95％乙醇和10秒的旋渦混合的。

放置在一個收集管一列，并轉移裂解外來列和離心1分鐘14 000 X G.

包含exosomal RNA和離心1分鐘14 000 X G.列加入400μL洗滌液洗三次

離心2分鐘14 000 XG，以確保該列是干的，并放置在一個無RNase Eppendorf管干欄列。

加入50μL洗脫液列和2型離心機 200 XG分鐘，其次是1分鐘14 000 X G.

繼續分離出的RNA，或存放在-80 ° C。