細胞膜遠紅外熒光染色試劑盒(DiD)，Cell Plasma Membrane Staining Kit with DiD (Far-red Fluorescence)是一種以DiD為熒光探針，并提供了染色增強劑、能快速靈敏地對細胞膜進行遠紅外熒光染色標記的試劑盒。

DiD即DiIC18(5)，也稱為DiD' solid，全稱為1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine,4-Chlorobenzenesulfonate Salt，分子式為C67H103ClN2O3S，分子量為1052.08。DiD是DiI的類似物，但具有更長的激發和發射波長，為遠紅外熒光，在一些細胞和組織染色中更有優勢，特別適合用于進行多種熒光的同時染色。DiD是一種親脂性羰花青(carbocyanine)染料，具有很長的親脂性烴鏈，進入細胞膜后可以側向擴散逐漸使整個細胞的細胞膜被染色，染色后非常穩定。

DiD可被633nm的氦-氖(He-Ne)激光所激發，DiD在進入細胞膜之前熒光非常弱，僅當進入到細胞膜后才可以被激發出很強的熒光。DiD被激發后可以發出遠紅外的熒光，DiD和磷酯雙層膜結合后的激發光譜和發射光譜參考圖1。其中，最大激發波長為644nm，最大發射波長為665nm。

圖1. DiD和磷酯雙層膜結合后的激發光譜和發射光譜。

DiD被廣泛用于正向或逆向的、活的或固定的神經等細胞或組織的示蹤劑或長期示蹤劑(long-term tracer)。DiD毒性很低，通常不會影響細胞的生存力(viability)。

本試劑盒提供了染色增強劑，使細胞膜染色更加快速，熒光染色更加明亮，染色背景更低。

本試劑盒除了最簡單的細胞膜熒光標記外，還可以用于檢測細胞的融合和粘附，檢測發育或移植過程中細胞遷移，通過FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)檢測脂在細胞膜上的擴散，檢測細胞毒性和標記脂蛋白等。

本試劑盒可以直接染色活的細胞或組織，染色時間通常為5-20分鐘。對于固定的細胞或組織，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛進行固定，使用其它不適當的固定液會導致熒光背景較高。本試劑盒對HeLa細胞的染色效果參考圖2。

圖2. 細胞膜遠紅外熒光染色試劑盒(DiD)對HeLa細胞的染色效果。DiD的染色時間為10分鐘。

DiD染色后可以兼容免疫熒光實驗。建議使用免疫染色通透液(Saponin) (P0095)或使用洋地黃皂苷(ST1272)配制的不會溶解細胞膜的通透液進行通透，其它去垢劑配制的通透液可能會溶解細胞膜上的脂類物質，造成DiD失去結合位置，最終導致DiD的染色失效。但通透也可能會影響DiD在細胞膜上的定位并會增加細胞內的染色，具體實驗中需根據實驗的需求選擇合適的細胞通透液。

本試劑盒小包裝C1995S，如果用于流式細胞儀，每個樣品的檢測體系體積為0.5ml時，可以進行200次檢測；96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時可以進行1000次檢測。

包裝清單：

保存條件：

-20℃避光保存，一年有效。染色增強劑(400X)和染色緩沖液也可保存在4℃。

注意事項：

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

染色緩沖液經過過濾除菌處理，在使用時須注意避免微生物污染，否則很可能嚴重影響染色效果。如果染色緩沖液發生渾濁等明顯的微生物污染，就不能繼續使用。

如果染色時間過長或染色后細胞繼續培養，探針也可能進入細胞內而染色其它細胞器的膜。

本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.溶液制備：
a.細胞膜染色工作液的用量：對于6、12、24、96孔板，每孔的細胞膜染色工作液分別為1~2ml、0.5~1ml、300~500μl和50~100μl；對于流式細胞樣品，每個樣品的細胞膜染色工作液為0.5ml；對于切片，可以根據切片大小，每個切片使用100-200μl的細胞膜染色工作液。
b.細胞膜染色工作液的配制：根據樣品數量和每個樣品所需工作液的體積，計算出細胞膜染色工作液的總體積。以流式細胞儀檢測為例，每個樣品的細胞膜染色工作液為0.5ml，參照下表配制細胞膜染色工作液。
注意：請嚴格按照下表中組分順序和體積配制細胞膜染色工作液，且DiD (400X)和染色增強劑(400X)混勻后再加入染色緩沖液。對于活細胞染色的情況，如果細胞對于培養條件非常敏感，也可以使用正常的細胞培養液代替本試劑盒提供的染色緩沖液用于配制細胞膜染色工作液。使用正常的細胞培養液替代染色緩沖液的情況，可能會導致染色效果有所下降，此時需要適當考慮延長染色時間或加大DiD染料濃度。

注：不同細胞的最佳染色濃度略有不同，細胞膜染色工作液的最終濃度建議根據不同細胞系和實驗體系進行優化，可在1:100-1:400之間進行調整。DiD的最終濃度提高時，染色增強劑的用量不變。
2.懸浮活細胞染色：
a.加入適當體積的細胞膜染色工作液重懸細胞，使其密度為1-2×106/ml左右。
b.37℃避光孵育細胞5-20min，不同的細胞最佳孵育時間不同。以5min作為初始孵育時間，根據實際所用的細胞優化染色時間，以得到最佳的熒光染色效果。
c.500-1000×g室溫離心5min。
d.吸除上清液，再次緩慢加入37℃預熱的細胞培養液重懸細胞。
e.重復c、d步驟兩次。
f.流式細胞儀檢測，或將細胞轉移至多孔板、細胞培養皿或者細胞爬片上，在熒光顯微鏡下觀察。DiD的最大激發光波長為644nm，最大發射光波長為665nm。
3.貼壁活細胞染色：
a.將貼壁細胞種于細胞培養皿、多孔細胞培養板或者細胞爬片上。
b.吸除細胞培養液，用Hanks' Balanced Salt Solution (C0218或C0219)或PBS (C0221A、C0221D或C0221G)洗滌細胞2遍。
c.加入適當體積的細胞膜染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。
d.37℃避光孵育細胞5-20min，不同的細胞最佳培養時間不同。以5min作為初始孵育時間，根據實際所用的細胞優化染色時間，以得到最佳的熒光染色效果。
e.吸除細胞膜染色工作液，用Hanks' Balanced Salt Solution或PBS洗滌2-3次，然后加入37℃預熱的細胞培養液即可在熒光顯微鏡下觀察。DiD的最大激發光波長為644nm，最大發射光波長為665nm。
4.染色后的固定和通透：
a.固定：如果樣品需要進一步進行免疫熒光實驗，建議使用免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定液(P0099)進行固定。
b.通透：建議使用0.1% Triton X-100 (ST795)或洋地黃皂苷(ST1272)進行通透。但通透可能會影響DiD在細胞膜的定位并會增加細胞內的染色，具體實驗中需根據實驗的需求選擇合適的細胞通透液。
注：如果需要封片，建議直接用PBS進行封片。請避免使用含有甘油或其它有機物的封片劑，否則會影響染色并增加熒光背景。
5.固定后細胞或切片的染色：
a.使用4%多聚甲醛固定液(P0099)或免疫染色固定液(P0098)進行固定。
b.吸除固定液，用PBS洗滌細胞3遍。
c.選做：使用配制在PBS中的0.1% Triton X-100 (ST795)進行通透，室溫10min。然后用PBS洗滌細胞3遍。
d.選做：按照免疫染色的方法進行抗體的孵育或用其它染料進行染色。注意：抗體孵育步驟中的封閉液、抗體稀釋液及洗滌液不能含有去垢劑。
e.加入適當體積的細胞膜染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞或樣品。
f.37℃避光孵育5-20min，最佳染色時間需要根據自己的實驗條件摸索，以達到最佳的熒光染色效果。
g.吸除細胞膜染色工作液，用PBS洗滌2-3次，隨后即可在熒光顯微鏡下觀察。DiD的最大激發光波長為644nm，最大發射光波長為665nm。​