線粒體通透性轉換孔檢測試劑盒(Mitochondrial Permeability Transition Pore Assay Kit or MPTP Assay Kit)是一種采用膜通透性的熒光探針Calcein AM檢測線粒體通透性轉換孔開放程度的試劑盒，也常用于研究細胞凋亡、壞死等細胞死亡。本試劑盒比基于線粒體膜電位的方法能更直接地檢測到線粒體通透性轉換孔開放程度的變化。

線粒體(mitochondrial)是細胞的能量中心，同時在細胞凋亡和壞死性細胞死亡過程中有著非常重要的作用。線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP或mPTP)，又稱線粒體巨型通道(mitochondrial megachannel, MMC)，是一種由線粒體膜內膜和外膜組成的非特異性的通道，在細胞死亡過程中參與線粒體內物質的釋放。線粒體通透性轉換孔的開放是引起細胞死亡的關鍵事件，在細胞的生存和凋亡的調控過程中扮演著重要角色，同時線粒體通透性轉換孔在心肌缺血、再灌注損傷、創傷性腦損傷、中風等心血管疾病及腫瘤、衰老、神經變性等多個方面都有重要作用。
在健康的細胞中，線粒體內膜可維持正常的線粒體膜電位梯度以保證細胞呼吸及能量供應。隨著Ca2+被線粒體攝入和釋放，其通透性轉換孔在張開和閉合狀態中來回切換。但在細胞凋亡或死亡的過程中，線粒體通透性轉換孔的開放顯著改變了線粒體的通透性。持續的線粒體通透性轉換孔開放，導致Ca2+過載、線粒體氧化型谷胱甘肽、線粒體中活性氧水平升高，最終導致細胞色素C的釋放及線粒體膜電位降低和消失。同時，線粒體通透性轉換孔具有感受器的功能，如Ca2+的過載、細胞色素C的釋放及膜電位的消失等也會誘導該孔的持續激活。
線粒體通透性轉換孔檢測試劑盒的檢測原理如下。試劑盒使用熒光探針鈣黃綠素乙酰甲酯(calcein acetoxymethyl ester, 即Calcein AM)染色細胞。Calcein AM是一種可以對活細胞進行熒光染色的非極性染料，可通過被動運輸進入細胞內并在細胞質組分包括線粒體等中積累。在細胞中，幾乎沒有熒光的Calcein AM被細胞內的酯酶水解去除乙酰甲酯，生成沒有膜通透性的極性熒光染料鈣黃綠素(Calcein or Fluorexon)，從而使Calcein滯留在細胞內，并使細胞質包括線粒體等呈現強綠色熒光。Calcein本身是一種金屬絡合指示劑，在生理pH條件下和Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe3+和Mn2+等金屬離子絡合時，熒光信號會發生淬滅。本試劑盒提供了CoCl2用于淬滅細胞質中Calcein的綠色熒光，但由于正常情況下線粒體的MPTP是關閉的，此時CoCl2不能進入線粒體，所以Calcein AM染色后經CoCl2處理會導致僅線粒體內呈現Calcein的綠色熒光。作為對照，可將細胞用Calcein AM染色并經過CoCl2處理之后，用鈣離子載體Ionomycin進一步處理以誘導細胞外的Ca2+大量進入細胞內和線粒體基質并導致MPTP的開放，或者用適當的條件刺激細胞導致MPTP少量或大量開放，從而使部分Calcein釋放進入細胞漿和鈷離子結合而失去熒光，同時細胞漿中的鈷離子能進入線粒體內而導致其中的Calcein的綠色熒光部分甚至全部淬滅，最終導致線粒體中Calcein綠色熒光減弱或消失。這樣就可以根據線粒體中Calcein綠色熒光的強弱來判斷線粒體MPTP開放的程度，綠色熒光越強，開放程度越低，綠色熒光越弱開放程度越高。本試劑盒的原理參考圖1。

圖1. 線粒體通透性轉換孔(MPTP)檢測試劑盒原理圖。Calcein AM進入活細胞后被酯酶(Esterase)催化生成Calcein，整個細胞都呈現很強的綠色熒光；氯化鈷(含Co2+)處理后呈現綠色熒光的Calcein結合鈷離子生成沒有熒光的Calcein-2Co，但正常情況下MPTP沒有打開從而鈷離子不能進入線粒體，因此此時僅線粒體中呈現綠色熒光；進一步用Ionomycin處理后，使鈣離子進入細胞內，導致MPTP打開，使部分Calcein從線粒體內釋放，同時鈷離子進入線粒體內從而使線粒體內呈現綠色熒光的Calcein也生成了沒有熒光的Calcein-2Co。如果有樣品可以誘導MPTP的部分或全部打開，就會導致線粒體中的綠色熒光減弱甚至消失。

Calcein AM水解產物Calcein的最大激發光波長為494nm，最大發射光波長為517nm。Calcein的激發光譜和發射光譜參考圖2。

圖2. Calcein的激發光譜和發射光譜。

本試劑盒內提供了1000X的Calcein AM，為了得到滿意的結果，對于不同的細胞類型請自行進行一定摸索，Calcein AM的終濃度一般為0.1X-5X，最優先的推薦終濃度為1X。使用本試劑盒檢測線粒體通透性轉換孔開放的效果參考圖3。

圖3. 使用線粒體通透性轉換孔(MPTP)檢測試劑盒檢測MPTP開放的效果圖。Calcein AM (1X)與L-929細胞進行孵育，細胞質包括線粒體發出強綠色熒光(A)；細胞進一步與CoCl2 (1X)孵育以后，細胞質內Calcein的綠色熒光被CoCl2淬滅，僅留下線粒體內的綠色熒光(B)；使用Ionomycin (1X)處理細胞，誘導細胞外的Ca2+大量進入細胞內，過多的Ca2+進入線粒體基質，導致MPTP的開放，使部分Calcein從線粒體內釋放，同時使鈷離子進入線粒體內并導致Calcein的綠色熒光淬滅(C)；使用解耦聯劑CCCP和FCCP (5μM)處理細胞，雖然線粒體膜電位丟失，但短時間內不會直接引起MPTP的開放，因此線粒體內綠色熒光強度無明顯變化(D、E)。

由于Calcein AM的毒性特別低，并且不會抑制細胞的增殖、趨化性等絕大部分功能，所以與其它同類產品如CFDA SE等相比是更適合染活細胞的熒光探針。
本試劑盒小包裝C2009S，如果用于流式細胞儀，每個樣品的檢測體系體積為1ml時，可以進行100次檢測；96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時可以檢測1000次。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。Calcein AM (1000X)和Ionomycin (200X)需要避光保存。
注意事項：
熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
Calcein AM (1000X)須盡量避免反復凍融。如果多次使用，請注意適當分裝。
CoCl2有腐蝕性，對人體有害或有刺激性，對人體有呼吸道、生殖等特定器官毒性，或致畸致癌毒性，操作時請小心，并確保有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內，并須注意避免腐蝕其它物品。
CoCl2對水生生物有毒或有害，禁止直接排入環境。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.溶液準備：
a.Calcein AM染色液(Calcein AM staining solution)的配制：以10個樣品使用流式細胞儀檢測為例，需要配制10ml Calcein AM染色液，即取10μl的Calcein AM (1000X)和100μl促溶劑(100X)加入到10ml的檢測緩沖液(Assay buffer)中混勻。
注1：促溶劑可增強Calcein AM的水溶性、減少Calcein AM在檢測緩沖液中的析出、改善染色效果并降低熒光背景。促溶劑非必須，特殊情況下也可不添加于檢測緩沖液中。
注2：Calcein AM染色液建議現配制現使用，不能長期保存，請根據待檢測的樣品數量，計算出Calcein AM染色液的使用量。
注3：本試劑盒中提供的檢測緩沖液含有Ca2+，可在一段時間內維持細胞的正常狀態，并給細胞提供一定的營養，效果比PBS或HBSS更好；檢測緩沖液也可用細胞培養液代替，但培養液中不能含有血清，否則會影響Calcein AM的進入細胞內的效率。
注4：染色液中Calcein AM的最終濃度需根據不同細胞系和實驗體系通過預實驗進行優化。Calcein AM的推薦工作濃度為1X，可以在0.1X-5X范圍內摸索最佳工作濃度。
b.熒光淬滅工作液(Fluorescence quenching solution)的配制：在Calcein AM染色液中添加CoCl2 (100X)使其終濃度為1X。例如，每1ml Calcein AM染色液中加入10μl的CoCl2 (100X)，混勻。
注：CoCl2的終濃度推薦為1X，通常此時的淬滅效果比較好。CoCl2的終濃度也可以根據實驗中所使用細胞的種類進行適當優化，以摸索出最佳的淬滅效果，可在0.1X-1X之間進行調整。
c.Ionomycin對照(Ionomycin control)的配制：在熒光淬滅工作液中加入Ionomycin (200X)使其終濃度為1X。例如，每1ml熒光淬滅工作液中加入5μl的Ionomycin (200X)，混勻。
注：Ionomycin的終濃度建議為0.5μM，也可以在0.4X-6X之間進行調整。
d.各種溶液配制見下表(其中檢測緩沖液即Assay buffer中根據需要添加促溶劑)。以各配制10ml為例，實際溶液需求量根據實驗方案和樣品數量而定：

2.貼壁細胞的熒光顯微鏡檢測：
a.將細胞接種于培養皿、多孔細胞培養板或者細胞爬片上，按實驗設計對細胞進行一定處理。
b.吸除培養液，用PBS清洗細胞1-2遍。
c.加入適當體積的Calcein AM染色液、熒光淬滅工作液或Ionomycin對照，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。一般96孔板每孔體積為100μl，24孔板每孔體積為250μl，12孔板每孔體積為500μl，6孔板每孔體積為1ml。
d.37℃避光孵育30-45min，不同的細胞最佳孵育時間有所不同。以30min作為初始孵育時間，根據所用細胞對孵育時間進行適當優化以得到最佳效果。
e.孵育結束后，更換成新鮮的37℃預熱的培養液，37℃再避光孵育30min，以保證細胞內酯酶充分水解Calcein AM以生成有綠色熒光的Calcein。
f.吸除培養液，用PBS清洗2-3次，然后加入檢測緩沖液即可在熒光顯微鏡下觀察。如有需要，也可進行進一步非綠色熒光的染色。如用Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或細胞凋亡與壞死檢測試劑盒(C1056)檢測細胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細胞核等。注意整個過程均需避光操作。
3.懸浮細胞的熒光顯微鏡檢測：
a.細胞按實驗設計進行一定處理后，計數。取適當細胞1000g室溫離心5min，棄上清，加入適當體積的Calcein AM染色液、熒光淬滅工作液或Ionomycin對照，使細胞密度約為1×106/ml。
b.37℃避光孵育30-45min，不同的細胞最佳孵育時間有所不同。以30min作為初始孵育時間，根據所用細胞對孵育時間進行適當優化以得到最佳效果。
c.孵育結束后，1000g室溫離心5min，吸除上清液，緩慢加入37℃預熱的培養液重懸細胞。
d.重復步驟c兩次或以上。
e.更換新鮮的37℃預熱的培養液，37℃再避光孵育30分鐘，以保證細胞內酯酶充分水解Calcein AM以生成有綠色熒光的Calcein。
f.1000g室溫離心5min，吸除大部分培養液，將細胞重懸后涂片，在熒光顯微鏡下觀察。如用Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或細胞凋亡與壞死檢測試劑盒(C1056)檢測細胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細胞核等。注意整個過程均需避光操作。
4.流式細胞儀檢測：
a.貼壁細胞胰酶消化后用培養液重懸、懸浮細胞直接使用，計數，取適量細胞1000g室溫離心5min，棄上清，加入適當體積的檢測緩沖液、Calcein AM染色液、熒光淬滅工作液或Ionomycin對照重懸，使細胞為單細胞懸液，并且細胞密度為1×106/ml，每個樣品體積為1ml。注：需要準備好僅含檢測緩沖液的細胞樣品用作流式細胞儀檢測時的陰性對照。
b.37℃避光孵育30min。
c.孵育完成后，1000g室溫離心5min收集細胞。每個樣品加入1ml檢測緩沖液，輕輕重懸，1000g室溫離心5min收集細胞。
注：本步驟可去除多余染料及可能引起熒光淬滅的試劑。
d.用400µl檢測緩沖液重懸細胞。如有需要，也可進行進一步染色。如用Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或細胞凋亡與壞死檢測試劑盒(C1056)檢測細胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細胞核等。注意整個過程均需避光操作。染色后，將樣品置于冰上，可以在1小時內進行流式細胞儀檢測和分析。
e.注意使用僅含檢測緩沖液的并且未經染色的細胞樣品用于流式細胞儀的陰性對照設置。Calcein的最大激發光波長為494nm，最大發射光波長為517nm。
5.結果示例：
a-僅含Calcein AM：線粒體和細胞質都有綠色熒光，熒光信號較強(參考圖3A)；
b-含Calcein AM和CoCl2：僅線粒體有綠色熒光，熒光強度中等(參考圖3B)；
c-含Calcein AM、CoCl2和Ionomycin：線粒體和細胞質綠色熒光均被淬滅，熒光信號比較弱或者幾乎沒有(參考圖3C)。
b和c的綠色熒光信號變化說明線粒體通透性轉換孔被打開，從而部分Calcein從線粒體內被釋放，同時導致鈷離子進入線粒體內而引起其中的Calcein綠色熒光發生淬滅。

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