Calcein-AM/PI 活細胞/死細胞雙染試劑盒說明書
貨號：YS1630M
規格：500T
保存：-20°C 避光干燥保存，一年有效。
產品內容：
| 名稱 | 規格 | 保存 |
| Calcein-AM Solution(2mM) | 50μL | -20°C 避光干燥保存 |
| PI Solution (1.5 mM) | 150μL | -20°C 避光干燥保存 |
| 10×Assay Buffer | 50mL | -20℃保存，經常使用可放在 4℃保存。 |
產品說明：
Calcein-AM 是 一種對 活細 胞進 行 熒光 標記 的細 胞 染色試劑 ， 發 綠色 熒 光 ( Ex=490nm, Em=515nm) 。因其在傳統的 Calcein (鈣黃綠素) 基礎上引入乙酰甲氧基甲酯 (AM) 基團，增加了 疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞后，Calcein-AM (本身不發熒光) 被細胞內的 酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子 Calcein，從而被滯留在細胞內并發出強綠色熒光。與其它同類 試劑 (如 BCECF-AM 和 CFDA)相比，由于 Calcein, AM 細胞毒性極低，是最適合用于活細胞染色的 熒光探針，而且不會抑制任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。
由于死細胞缺乏酯酶，Calcein-AM 僅用于對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記。因此， Calcein-AM 常常與死細胞熒光探針如碘化丙啶 (PI) 等聯合使用，同時進行活細胞和死細胞的熒光 雙重染色。碘化丙啶 (Propidium iodide ，PI) 不能穿過活細胞的細胞膜，僅能穿過死細胞膜的無序 區域而到達細胞核，并嵌入細胞的 DNA 雙螺旋從而產生紅色熒光 (Ex=535 nm, Em=617 nm)，因此 PI 僅對死細胞染色。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活 細胞和死細胞。而用 545 nm 激發，僅可觀察到死細胞。
本試劑盒的工作原理就在于 Calcein-AM 和 PI 的雙重染料，來進行活細胞和死細胞的雙重染色 標記，從而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據我司優化的實驗體系，單次就 200µL 細胞懸液進 行染色，可以做 500 次檢測。
使用方法 (僅供參考)：
1. 工作液的前處理
( 1) 從低溫冰箱內取出 10×Assay Buffer，根據單次用量無菌條件取出適量，用去離子水 10 倍稀釋 以得到 1×Assay Buffer。
(2) 由于 Calcein-AM 的穩定性受溫度影響較大，建議收到貨后，可分裝為小份，密封避光保存于 -20℃ ，不能反復凍融。若染色液經稀釋，建議當天用完。
2. 細胞處理
( 1) 懸浮生長的細胞，收集至離心管，450g ，離心 5min ，去除上清。用 1x 的 Assay Buffer 洗滌 細胞，450g ，離心 5min ，2 次，去除殘留酯酶。
(2) 貼壁細胞經 0.25%胰酶-EDTA 消化后，收集細胞，用 1x 的 Assay Buffer 洗滌細胞，450g ，離 心 5min ，2 次，去除胰酶及殘留的酯酶。
3. 染色步驟
( 1) 離心得到的細胞沉淀用 1×Assay Buffer 重懸，使重懸后細胞懸液計數細胞量為 1×105~6 個/ml。
(2) 每 1ml 的細胞量加入 1-2ul 的 Calcein-AM (原液)，吹打混勻，37℃避光孵育 20min-25min。
(3) 將試劑盒自帶的 PI 原液取 3-5ul 加入上述染色細胞中，室溫避光染色 5min。
(4) 孵育熒光后的細胞，450g ，5min ，離心去除染色液。 注：細胞進行熒光染色時建議全程避光。
(5) 用 1x 的 PBS 清洗細胞 450g ，5min ，離心后用 1x PBS 重懸細胞，取 3-5ul 滴在潔凈的載玻片 上，用干凈的蓋玻片壓片后，請及時熒光鏡檢。
(6) 熒光顯微鏡下使用 490± 10 nm 激發濾片同時檢測活細胞 (黃綠色熒光) 以及死細胞 (紅色熒 光)。另外，使用 545nm 的發射濾片僅能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀下使用合適 的濾片進行檢測。
注意事項：
( 1) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
(2) 貼壁細胞也可以不消化，直接去除培養基，經 1×Assay Buffer 浸洗 2min ，2 次。按上述細胞量 和染色液濃度比例進行染色，染色時間和染色液工作濃度可按實際檢測調整。
(3) Calcein-AM 作用于細胞，一般細胞量在 1×105-6 個時，Calcein-AM 的工作濃度基本在 1-2µM； PI 的工作濃度在 5µM 。但由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以 確定 Calcein-AM 和 PI 的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最低的探針濃度得到最好的熒光結 果。
(4) 碘化丙啶 (PI) 有一定的致癌性，操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚，需要立即用自來水 清洗。
注：可以使用以下方法來優化得到兩種熒光染料針對不同細胞的最佳工作濃度。
a) 用 0. 1%皂素或者 0. 1-0.5%地高辛孵育細胞 10min ，或者用 70%乙醇孵育細胞 30min ，從而制 備死細胞；
b) 用 0. 1- 10µM 的 PI 溶液進行死細胞染色，以得到僅僅對細胞核染色，而不會對細胞質染色的 最佳工作濃度。
c) 用 0. 1- 10µM 的 Calcein-AM 進行死細胞染色，以得到不會對細胞質染色的最佳工作濃度。然 后用此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能被染色。
