抗原修復技術及其在免疫組化中的應用

福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內或分子間形成了醛鍵，使得不少抗原決定簇被封閉。同時，由于甲醛的聚合作用，使蛋白質分子間相互交聯形成大分子網絡，也導致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應。因此，抗原修復也是影響免疫組化染色結果的基本因素。抗原修復(Antigen retrieval ，AR)技術，建立在Fraenkel-conrat等人[1]一系列生物化學研究，經1991年shi等人[2]發展。抗原修復是指石蠟、冰凍、火棉膠、塑料切片免疫組織化學（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性劑、微波緩沖液和金屬鹽等，使被掩蓋的抗原決定簇或變性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢復過程。抗原修復能最大程度地恢復在制片等過程中損失的抗原性，使原來認為不能在石蠟切片上進行IHC的許多抗體獲得了良好的染色結果，成為一種有效的補救措施。本文的目的是概述AR-HIC的發展、應用和標準化。

一、 AR技術
加熱AR技術

微波加熱方法. 在傳統標準方法,經脫蠟、脫水和用3%H2O2阻斷內源性過氧(化)物酶，石蠟切片經蒸餾水沖洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸餾水、緩沖液、金屬鹽液、尿素等，蓋上并置家用微波爐加熱5或10分鐘（注意防止切片干躁）。有時在加熱5分鐘后，間隔1分鐘，再加熱5分鐘（在第一個5分鐘后檢測液體高度）。加熱后，從微波爐取出塑料Coplin缸，冷卻15分鐘。片子經蒸餾水沖洗二次后在PBS液中浸5分鐘，才進行IHC染色。為了保持一致的加熱條件，必須設定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號的Coplin缸 ，按照不同的抗體設定不同的加熱時間，盡可能的建立標準的加熱條件。

微波（MW）加熱過程如下：在專用盒內放入200ml檸檬酸緩沖液（PH6.0±0.1），并蓋上帶有小孔的蓋子，微波加熱至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中，放入已沸騰緩沖液中，有作者提供做免疫組化時采用微波爐中等功率800W[3]，微波爐選用解凍檔的國產家用微波爐(根據目前的研究,建議用醫用微波爐)，中檔繼續處理10-20分鐘；取出微波塑料缸冷卻至室溫，從緩沖液中取出玻片，片子經蒸餾水沖洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）沖洗兩次，每次3分鐘。
盡管有少數作者[4]認為經高溫后冷卻這一步省略。在我們觀點，15分鐘的冷卻必須的幾點理由：1、如這一步省略，對于有些抗體而言，會降低AR-IHC染色強度。2、突然從高溫到低溫可導致組織片掉片。3、可能引起形態學的變化。
  單純加熱方法.  將切片放入盛有檸檬酸緩沖液的容器中,置電爐（600W）上加熱至沸騰，并持續10min 。Shi等人[2]用單純加熱方法與微波加熱方法比較IHC染色強度，顯示兩種方法導致相同的染色強度。
  高壓加熱方法.  Shin等人[5]發展了含水高壓鍋煮沸方法，來增強福爾馬林固定的腦組織tau蛋白免疫反應性。將切片連同檸檬酸緩沖液放入高壓鍋內，加熱至產生噴氣，并持續2min，壓力鍋離開熱源，加熱長短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋到壓力鍋離開熱源總時間在5-8分鐘，時間過長可能會使染色背景加深。現試劑公司提供的大多數抗體都建議使用高壓鍋煮沸方法，這幾年的實踐表明，采取此方法可避免假陽、陰性，使IHC染色效果更佳。
非加熱AR技術
   非加熱AR技術包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化學的方法來打斷醛鍵，修復抗原。

胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05％或0.1％PH7.8的無水氯化鈣水溶液中，溶解即可；或由邁新提供的0.125%的液體胰酶。將切片放入濕盒內37oC溫箱中消化18-20分鐘。
    胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4％的胃蛋白酶；

鏈霉蛋白酶消化法 . 將鏈霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，濃度為o.1％，消化時間20min。
    抗原修復的方法選擇，關系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。因此應當根據不同的抗原特點，采用不同的修復方法。對某些細胞內抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和細胞間質抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片。常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細胞內抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細胞間抗原的消化。工作中要認真參照抗體說明書指示進行消化酶的選擇，這樣針對性更強，標記效果更理想。
    總之,以高壓加熱方法、微波加熱方法較為穩定, 高壓加熱方法效果優于微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對修復效果無任何影響，而PH值則影響較大。緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCL較常用。前人的研究表明，溫度高修復時間短[6]。解放軍第251醫院根據臨床病理診斷、鑒別診斷和研究的實際需要，在抗原修復方法規范研究和應用的基礎上，創用了胰蛋白酶—尿素聯合消化技術、鹽酸水解暴露抗原技術和MW—表面活性劑Triton X—100（MW—TX）修復抗原技術 [7] 。抗原暴露或抗原修復方法較多，其中發MW—枸櫞酸緩沖液使用較多，效果最好。MW修復抗原的方法是石蠟切片脫蠟、水洗后放入修復液中，用250W的輸出功率2X5min，待冷卻至室溫按常規處理。目前AR過程已成功應用在BioTek全自動免疫組化染色儀中。

二、AR應注意的問題

加熱持續時間和強度是重要的影響因素之一，AR液的PH值、濃度、化學成分也是重要的影響因素之一。使用低PH值AR液必須使用陰性對照片，以防止定位不準[9]。Shi等人[10]強調修復緩沖液的PH值對某些抗原的修復十分重要,實驗中我們也發現要獲得滿意結果必須選擇抗原修復液的最適PH值。在常規石蠟切片做AR-IHC，采用不同濃度的Alcl3液做AR液，發現4%的Alcl3取得最理想的染色[11]。在修復的抗原中，金屬鹽可影響蛋白的結構。鄭輝等人[12]使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L檸檬酸緩沖液、0.1mol/L Tris-HCL緩沖液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修復抗原，發現其陽性強度逐漸增強。

高溫抗原修復因其機理相當復雜，對某些存在的問題很難用設計對照的方法加以解決，有些抗體在冰凍切片上呈陰性反應，但在石蠟切片用抗原修復后卻能很好的顯示。對某些應表達在胞漿或表達在核內的抗原，經過量修復后，絕大部分表達在核內，例如，P185、Bcl-2、P-gp、Nm23，而有些表達在核內的抗原經過量修復會出現在胞漿內，例如P53、PcNA、Ki-67等[6]。在使用該方法時一定小心，對結果的判斷也要客觀地作出分析，侯寧等人發現端粒酶逆轉錄酶（TRT）經過抗原修復與不經過抗原修復，其染色效果明顯不同，后者的陽性率明顯高于前者[8]。操作中還應注意如下問題：
1、熱處理后應注意自然冷卻。
2、熱處理時要防止切片干燥。
3、應根據不同的抗體選擇合適的抗原修復方法。
4、一批抗原的檢測其溫度和時間一定保持一致。
5、注意形態學結構的改變(一般經高溫修復后胞漿會明顯的破壞，而對細胞核的影響較大，會出現核破裂，蘇木素淡染等現象，而經酶水解的切片，其細胞漿破壞視消化時間而異，但核破壞較輕)。
6、如果在常用的緩沖液中無法實現抗原修復，或經修復后抗原定位發生改變，可改用一些不常用的緩沖液，或加一些螯合劑，如EDTA等可改善某些抗原的修復。

用于IHC消化的酶很多，所選酶的種類，使用的濃度，PH值，消化時間及溫度等均要視組織固定的不同，所檢測抗原的性質、組織類型的不同而異，應通過預實驗摸索確定。使用酶消化的原則：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于細胞內抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。胃蛋白酶則主要用于細胞間質抗原的檢測，如fibronectin，Laminin，各型膠原等。一般來言，消化時間和組織固定的長短呈正比。在用酶消化，熱修復后均不能獲得結果的前提下使用抗原修復與酶消化結合的方法，有時會取得較為滿意的結果。一般蛋白酶K和微波相結合，但應注意，可能檢測的抗原無論何種性質均會在核內出現假陽性反應[6]。

三、AR的臨床應用。
   上個世紀九十年代早期，隨著AR技術的發展，IHC應用在常規處理火膠棉包埋的人類顳骨上，從分子水平上了解人類發病機理和病理生理學，創立了一個新的領域[13]。使用AR方法，在常規處理石蠟切片上評估IC5和ID15單克隆抗體的免疫組化染色[14]。 Charalambous. C等人 [15]強烈推薦MW-AR-IHC方法檢測R-S細胞的CD30。AR技術成功應用于原位雜交[16]。利用加熱AR-IHC技術，在福爾馬林固定、石蠟組織切片上用抗毒素#4350檢測nestin[17]。采用抗復技術，在人類上皮、神經、神經內分泌組織中免疫組化定位DCC蛋白[18]。AR-IHC已廣泛應用于臨床的研究中。

四、AR的標準化和發展
   抗原修復的確切原理尚不十分清楚，根據國內外文獻報道，推測可能是：1、溶解、洗脫變性蛋白。2、水解作用。3、微波場內離子或極性分子直接碰撞的修復作用[7]。抗原修復是否可能？理論上研究尚未清楚，但是以高溫、高壓、對常規石蠟切片進行抗原修復處理經驗表明，可以提高抗原抗體陽性檢測率，同時也會出現假陽性。
    診斷IHC上的AR技術及其在基礎領域的研究已被為數眾多的文獻和比較多的綜述所闡述。此領域的調查目的：從分子生物學診斷常規上，在石蠟組織中檢測核酸和蛋白質新途徑的可能性，從而形成新興的分子形態學。一些新的途徑必須建立標準化的原則和提高其重復性。[19] 。目前我國病理科大多數醫院病理科尚未在IHC、AR上標準化，國外已廣泛進行進行AR的標準化及IHC標準化[20]。例如在建立新的修復液方面，針對不同的抗體預定義加熱條件和液體濃度、PH值、化學成分，從而推動AR的標準化。
    現AR技術已廣泛應用于免疫組化（IHC）各領域的研究，例如在診斷病理學和IHC的標準化方面。對原來僅表達在冰凍切片上的抗原，利用AR后絕大部分抗體能用于常規甲醛固定的石蠟切片上，對IHC回顧性研究和臨床病理IHC鑒別診斷，腫瘤患者術后的預后檢測及療效評估具有積極的意義。