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成體骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法及注意事項

發(fā)布時間：2021/6/17 9:22:32 閱讀次數(shù)：850

成體骨骼肌細(xì)胞可以直接取自病人自身 ,可以避免細(xì)胞系載體的致瘤性及異種或異體載體的免疫源性。它是骨骼肌的前體細(xì)胞, 具有很強(qiáng)的增殖、分化能力。近年來, 作為高效的基因傳輸載體，成肌細(xì)胞在各種需要體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因治療的疾病，例如 Dhchenne 肌營養(yǎng)不良、血友病等中得到廣泛的應(yīng)用。

原代培養(yǎng)成年動物成肌細(xì)胞的方法以成年SD大鼠為實(shí)驗?zāi)Ｐ? 采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)成肌細(xì)胞，為自體細(xì)胞移植創(chuàng)造條件。

實(shí)驗步驟

1 . 組織取材 SD 大鼠乙醚吸入麻醉后腹腔內(nèi)注射氯胺酮(22 mg/kg)。以左側(cè)第 4 肋水平作橫切口, 取胸大肌約 1 cm3 , 并將其修剪成 1 mm3 大小的肌小粒。反復(fù)用Hanks 液洗去血細(xì)胞 , 將肌小粒小心貼附于事先用明膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部 , 加入適量成肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液(Ham' s F-10 培養(yǎng)基中加入15 %小牛血清、青霉素100 U/ml 、鏈霉素 100 U/ml)。將瓶底向上輕置于37℃、5 %CO2 、飽和濕度的培養(yǎng)箱中, 4 h 后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶 , 使肌小粒浸浴于培養(yǎng)液中。 3 d 換液一次 , 待細(xì)胞長滿瓶底即可傳代。

       2 .成肌細(xì)胞的培養(yǎng) 采用組織塊培養(yǎng)法貼塊 2 d 后即可見有細(xì)胞從肌小粒邊緣爬出 , 細(xì)胞呈梭形, 胞漿透明。1 周后細(xì)胞可長滿瓶底的 60 %～ 70 %, 其數(shù)目可達(dá) 105 , 此時細(xì)胞可呈多角形 , 充分伸展, 部分細(xì)胞密集區(qū)可見細(xì)胞呈向心性生長 , 相互間排列整齊 , 類似骨骼肌的縱切面。
       3 .成肌細(xì)胞的分化鑒定將傳代后的細(xì)胞接種至 6 孔板, 加入增殖培養(yǎng)液 , 待細(xì)胞長至80 %滿時, 換入成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化液(低糖DMEM培養(yǎng)基中加入 2 %馬血清、0 .5%雞胚提取物、青霉0100 U/ml 、鏈霉素 100 U/ml), 換用誘導(dǎo)分化液后細(xì)胞可在 3 d 內(nèi)分化 , 融合交織形成肌纖維, 可觀察到收縮現(xiàn)象;并且部分細(xì)胞分化形成細(xì)長的肌管, 高倍鏡下可見多個核及核分裂象。這些現(xiàn)象為成肌細(xì)胞所特有, 可以作為簡便的鑒定方法。
       4.成肌細(xì)胞的免疫熒光鑒定
免疫熒光在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min。水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗（Desmin結(jié)蛋白）并放入濕盒，4℃孵育過夜；加熒光二抗：PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min。滴加DAPI避光孵育5min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
       注意事項
      （1）原代培養(yǎng)材料的選擇，盡量選取完整的組織。
     （2）要注意無菌操作。小心操作，避免污染細(xì)菌。其操作要求應(yīng)高于外科手術(shù)。
     （3）整個取材操作要迅速，不能過長，以確保細(xì)胞活性。
    （4）運(yùn)用消化法時胰酶溫度應(yīng)低于37℃，濃度只需平時消化細(xì)胞濃度的一半。所以胰酶不能作用過強(qiáng)，否則這些細(xì)胞易被損傷而不易生存。

（5）使用組織塊法，則應(yīng)待組織塊略干燥，能黏附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸，不要使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁，則細(xì)胞不易生長，即使生長也因沒有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無法收集到生長的細(xì)胞。