_{TRAP-銀染法端粒酶活性檢測試劑盒}

_{產品信息：Kim于1994年借助PCR技術建立了靈敏的端粒酶檢測方法——端粒重復片段擴增(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。本產品是在其方法的基礎上，進行適當改良，開發出來的研究用試劑盒。}

_{本品與通常的端粒酶活性測定法相比較，具有以下特征：}

_{1、內標與端粒酶提取液在同一管里進行PCR擴增，提高了檢測的準確性。}

_{2、提供了陽性對照，可以更加準確地判定陽性實驗結果。}

_{3、優化了引物設計，使PCR 效果進一步提高。}

_{使用須知：本試劑盒為研究用試劑，不能將其作為診斷或臨床檢測試劑使用。}

_{背景知識：端粒酶是合成染色體末端的端粒的酶。端粒（telomere）是真核細胞染色體的天然末端，由上千個6堿基重復序列(TTAGGG)組成，是細胞必需的遺傳組分，它的作用是維持端粒有足夠的長度，保證基因信息在復制過程中的準確性，以防止染色體末端遺傳信息的丟失。在正常情況下，每個細胞分裂周期都會使端粒變的越來越短，當端粒短到一定程度時就會發出信號，細胞停止分裂。}

_{端粒酶由RNA和蛋白質亞基組成，是基本的核蛋白逆轉錄酶，在細胞染色體復制過程中，能夠以自身RNA為模板，在染色體3’末端合成重復序列，維持端粒的長度。端粒酶在正常體細胞中的活性被抑制，但是大量的資料表明在一些惡性腫瘤中的表達高達85%。}

_{由于端粒酶特異地表達于各種腫瘤細胞，并且是大多數腫瘤細胞持續分裂所必需的。因此，端粒酶活性是診斷多數惡性腫瘤、判斷愈后的良好指標。}

_{基本原理：利用端粒酶在體外可以以其自身RNA的模板區為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6個堿基的重復序列的特性，采用PCR方法擴增此重復序列，并進而用聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳顯示6個堿基差異的梯帶。1994年Kim建立的TRAP法，其主要原理如下：首先合成一個18nt的TS做上游引物，端粒酶結合TS末端的GTT并合成AGGGTTAG，然后每經過一次轉位合成一個ggttag的6堿基重復序列，端粒酶滅活后，加入CX做下游引物，經過多次變性-退火-延伸，擴增端粒酶延伸產物。
 TBD-PCR端粒酶活性檢測試劑盒基于同樣的的原理，利用銀染技術檢測端粒酶的活性。陽性結果在凝膠電泳上顯示相隔6bp的梯狀條帶，條帶的多、寡、深或淺表示端粒酶活性的大小。TRAP-銀染法保留了傳統TRAP法靈敏度高、特異性強等優點，避免了同位素的放射污染。同時，還增設了內標準物，提供陽性對照品，優化了引物設計，使PCR效果進一步提高，使之能夠高靈敏的檢測到細胞和組織提取物中端粒酶的活性。}

_{試劑盒組成：}

_操作步驟

_{1、端粒酶的提取}

_{⑴ 手術后取下的活組織，立即保存在液氮之中。}

_{⑵ 40～100mg 冷凍（-70％℃）組織用無菌眼科手術剪盡量剪碎，研磨器研磨，加入 40 ul Lysis buffer（使用前每 ml Lysis buffer 加入 2μl  β-巰基乙醇）；或 1～2×106 沉淀細胞直接加入 40µl 預冷的 Lysis buffer，懸浮細胞，渦旋振蕩10s, 置冰浴中 30min，每間隔數分鐘渦旋振蕩一次，共 5-6 次。}

_{備注：為了獲取比較理想的端粒酶提取液，建議在一些干硬組織中適當加入 Wash buffer。}

_{⑶ 4℃離心（13000rpm,20min）。}

_{⑷ 移取上清，分裝 3-4 管，每管約 20μl。其中一份樣品用于蛋白質濃度定量，其余迅速冷凍，-70℃保存。}

 TRAP-銀染法端粒酶活性檢測試劑盒

_{2、PCR 擴增(1×25ul)}

_{3、PCR 擴增：}

_{⑴ 每管加入Ⅰ液 9μl 及端粒酶提取液 1μl，混勻，30℃反應 30min。}

_{⑵ 上述各管 93℃加熱 1min 滅活。}

_{⑶ 向上述各管中加入預熱至 93℃的Ⅱ液各 13ul，混勻，進行第一步擴增。擴增條件如下：}

_第一步：

_{（4）在第一步擴增最后一個循環的延伸一步的最后幾秒，暫停儀器運行，快速向各管中加入primer3 2ul 和稀釋后的內標準模板1ul。繼續運行儀器，進行第二步擴增。擴增條件如下：}

_（5）

_{第二步（連接第一步）：}

_{4、10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（所有溶液，用戶自備）}

_{⑴ 制備 10%非變性聚丙烯酰胺凝膠（20ml）。}

_{ddH2O11.19 ml}

_{36%Acr-1%Bis5.46 ml}

_{5%TEMED0.4 ml}

_{10×電泳緩沖液2 ml}

_{1.25% APS1 ml}

_{⑵ 取10ul PCR產物與2ul上樣緩沖液混合后加樣，用0.5×電泳緩沖液作為電極緩沖液，180V電泳2h。}

_{⑶ 小心剝離凝膠，并置于50%甲醇、10%醋酸中，固定過夜。}

_備注：

_{① 10×電泳緩沖液：15g Tris 、14g 硼酸和1.17g EDTA (不帶 2Na)  ，用ddH2O定容至 200ml。}

_{② 10×上樣緩沖液：0.01%溴酚蘭、40%甘油、62.5mM Tris-HCl(pH6.7)}

_{5、銀染（所有溶液，用戶自備）}

_{⑴ 將凝膠置于 10%醋酸固定30min后用蒸餾水漂洗3次，每次5min;}

_{⑵ 將凝膠置于0.2g/L 硫代硫酸鈉浸泡1min, 然后用蒸餾水漂洗3次，每次30s;}

_{⑶ 將凝膠置于硝酸銀染液中浸泡 30min, 然后用蒸餾水漂洗 30s;}

_{⑷ 將凝膠置于顯影液中顯色 10min 左右直到全部條帶顯色清晰為止；}

_{⑸ 將凝膠置于 5%醋酸中浸泡終止反應。}

_{⑹ 選擇適當時機照相。}

_備注：

_{① 硝酸銀染液：0.2g AgON3、25ul 37%甲醛，定容至 100ml。}

_{② 顯色液：3g Na2CO3、25ul 37%甲醛、0.4mg 硫代硫酸鈉，定容至 100ml。}

_{6使用凝膠分析軟件進行結果分析}

_{實驗方法的說明}

_{1、端粒酶的提取：端粒酶本身有RNA 和酶功能基團，極其容易被降解、失活。因此，應該按提取細胞總RNA 的要求，盡量在低溫條件下，快速操作。簡化不必要的反復洗滌程序，提高提取液的蛋白質濃度。小量分裝，盡量避免反復凍融。2、反應前，測定每個樣品的蛋白質濃度，并稀釋至同一濃度，以保證端粒酶樣品加入量基本一致。}

_{3、為了讓實驗更具有客觀性，實驗時，請務必設定陽性對照和陰性對照，本試劑盒提供陽性對照的模板，并提供陰性對照的實驗方法。陽性對照的實驗方法：另設一陽性對照管，以陽性對照模板代替端粒酶提取液加入即可。陰性對照的實驗方法：可以把I液II液混合，每管24ul混合液，再加入端粒酶提取液，混勻后直接在90℃加熱10min滅活，不經過PCR擴增，直接電泳，以排除樣品中存在的蛋白質對核酸銀染的干擾。}

_{4、關于內標準模板的使用為了便于進行各樣品間端粒酶活性的比較，我們提供了內標準物。該內標準物可以作為模板，用于檢測端粒酶活性的同一對引物進行擴增。內標準模板擴增片段長度為：50bp。}

_{該內標準物的使用有兩種方法：}

_{第一種方法：將內標準物以一定量加入到端粒酶樣品之中，用同一對引物在同一擴增管內進行競爭性擴增。然后通過比較電泳圖譜中內標準物和端粒酶擴增帶的相對強度，即可達到相對定量的目的。考慮到實驗方法的靈敏度，并避免PCR 擴增時的平臺效應，只有當端粒酶的模板（與其活性相對應）和內標的模板比例相接近時，方能得到較理想的分析效果。}

_{基于不同來源樣品的端粒酶的活性不同，需要將高濃度的模板進行一系列的稀釋，比如依次稀釋為100、1000、10000、100000、1000000 等倍數，分別取1ul與等體積的端粒酶樣品混合后作為模板，進行擴增。選擇一個內標準物和端粒酶均能明顯擴增的稀釋度用于今后的實驗。此種方法從理論上講更嚴謹，考慮到了模板的長度，擴增效果和端粒酶活性的關系，但是需要客戶自己摸索最佳條件。實驗室建議在端粒酶活性比較高的情況下將內標準模板稀釋10⁵再進行擴增。}

_{第二種方法：是將我們提供的高濃度內標準物，在進行電泳時加入。這樣也能夠實現半定量分析，而且方法簡單可行。} 

_常見問題

_{1、細胞提取物中沒有足夠的端粒酶：在冰浴條件下制備細胞和組織提取物，盡量縮短制備時間，適當用較高濃度的端粒酶樣品，減少不必要的操作。}

_{2、端粒酶的反應時間不夠：保證反應時間不少于20min。}

_{3、所有樣品和陰性對照都成陽性：PCR殘余污染。PCR反應的每一組分勿重復使用保證使用潔凈的PCR管和PCR試管架}

_{4、同一種組織會有不同的端粒酶的表達活性：動物本身就有種內差，每個個體的端粒酶的表達活性情況也會不一樣。同一個體的不同組織（如睪丸/骨髓）端粒酶的表達也不一定相同。同一個體的同一組織的不同部位端粒酶的表達情況也不一定相同。}

_{5、腫瘤組織中沒有出現預期的端粒酶條帶：腫瘤組織中端粒酶的表達達85%，也有部分腫瘤組織中沒有端粒酶的表達，所以極少數腫瘤組織中有可能沒有出現端粒酶的條帶。}

_{6、陽性對照中看不到梯度：因反復凍融會導致陽性對照中的端粒酶失活，所以應注意低溫操作。}

_{7、陰性對照里有梯度條帶出現：PCR產物、lysis buffer及反應試劑等交叉污染，請將PCR擴增產物提取區域和反應試劑配制區域分開。另外請經常使用手套。電泳上樣時的交叉污染，每次上樣時更換槍頭。}

_{8、由于熱處理、RNase處理不充分而引起梯度條帶消失：將要使用的槍頭用DEPC水浸泡至少24小時，再進行高壓滅菌，烤干；提取樣品所用的玻璃制品、陶瓷品及手術器械等經烤箱170℃烘烤5個小時。}

_{9、端粒酶活性不高：改善端粒酶反應條件，適當增加端粒酶反應時間，適當增加PCR循環數（但要避免達到平臺效應，使非特異性擴增大量出現），避免lysis buffer的惡化，盡量減少端粒酶樣品反復凍融。實驗操作的指導原則是快速，低溫。}

_{質量檢測報告：}

_{產品名稱：TRAP-銀染法端粒酶活性檢測試劑盒（TRAP-Silver Staining Telomerase Detection Kit）}

_{HL-60細胞在37℃，5%CO2 培養箱培養，并利用本試劑盒進行檢測，經電泳檢測PCR產物，呈現陽性梯帶，視為合格。}