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pECMV-Slc6a4-m-FLAG質(zhì)粒的使用方法

發(fā)布時(shí)間：2021/12/8 10:45:55 閱讀次數(shù)：534

使用方法

pECMV-Slc6a4-m-FLAG收到產(chǎn)品后，請(qǐng)先根據(jù)產(chǎn)品管壁標(biāo)簽來(lái)判斷產(chǎn)品形式，并在擴(kuò)增前準(zhǔn)確查找該質(zhì)粒的抗性、感受態(tài)和培養(yǎng)溫度。

1、質(zhì)粒干粉（請(qǐng)務(wù)必轉(zhuǎn)化挑單克隆重提后使用）

①收到質(zhì)粒干粉后請(qǐng)先5000rpm離心1min，再加入20μl 無(wú)菌水溶解質(zhì)粒；

②取2μl質(zhì)粒加至100μl 感受態(tài)中，冰浴30min后，42℃熱激60s，不要攪動(dòng)，再冰浴2min；

（從第二步開(kāi)始均要在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌操作）

③加入500μl無(wú)抗的LB液體培養(yǎng)基，180rpm震蕩培養(yǎng)45min；

④取10μl、100μl復(fù)蘇液，并分別涂布至目標(biāo)質(zhì)粒抗性的LB平板上；

⑤將平板正向培養(yǎng)1h，再倒置37度培養(yǎng)14h。如果要求是30度則培養(yǎng)20h；

（如果菌落過(guò)多，請(qǐng)將質(zhì)粒稀釋后再轉(zhuǎn)化。如果無(wú)菌落，請(qǐng)加入10μl質(zhì)粒離心全涂轉(zhuǎn)化）

⑥挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，加入對(duì)應(yīng)抗生素，220rpm震蕩培養(yǎng)14h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒。

2、甘油菌：四區(qū)劃線后挑單菌落培養(yǎng)，酵母菌需要先液體復(fù)蘇再四區(qū)劃線，再挑單菌落液體培養(yǎng)。

3、穿刺菌：穿刺接種，液體培養(yǎng)后四區(qū)劃線，再挑單菌落液體培養(yǎng)。

4、平板：直接挑取單菌落至液體培養(yǎng)基中。

5、液體質(zhì)粒：?jiǎn)为?dú)提取的液體質(zhì)粒收到后可直接使用。

pECMV-Slc6a4-m-FLAG是一個(gè)大腸桿菌表達(dá)載體，Tac強(qiáng)啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)GST促溶標(biāo)簽和目的基因融合表達(dá)，LacI阻礙蛋白和Laco操作子使本質(zhì)粒在沒(méi)有加入IPTG之前禁止表達(dá)，防止其影響細(xì)菌生長(zhǎng)。表達(dá)后的融合蛋白可用凝血酶蛋白酶切割，再過(guò)一次GST柱子即可清除掉GST標(biāo)簽。

操作流程
pECMV-Slc6a4-m-FLAG到貨后請(qǐng)根據(jù)標(biāo)簽上文字判斷產(chǎn)品屬性（質(zhì)粒/甘油菌）

1、收到質(zhì)粒干粉后請(qǐng)先5000rpm離心1min，再加入20μl無(wú)菌水溶解質(zhì)粒，室溫放置1min；

2、從-80℃冰箱中取出相應(yīng)的感受態(tài)，置于冰盒上解凍，并做好標(biāo)記；

3、取2μl質(zhì)粒加至100μl感受態(tài)中，冰浴30min；

4、42℃熱激90s，再冰浴2min；

5、加入900μl無(wú)抗的LB液體培養(yǎng)基，180rpm震蕩培養(yǎng)45min；

6、6000rpm離心5min，僅留100ul上清混勻菌體沉淀；

7、混勻后的菌液加至對(duì)應(yīng)抗性的LB平板上，倒入適量玻璃珠，涂勻液體；

8、將平板正向培養(yǎng)1h，再倒置培養(yǎng)12h~16h；

9、挑取單克隆菌落至對(duì)應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)12h~16h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要提取質(zhì)粒。