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發布時間：2021/12/8 10:50:24 閱讀次數：617
1材料
E.coliJM109菌株
2儀器、用具
超凈工作臺、離心機、恒溫搖床、恒溫培養箱、培養皿、試管、1.5ml離心管、電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、移液器
3試劑
(1)CaCl2、LB平板（見附錄）；SOC培養基（見附錄）；SOB培養基
(2)RNaseA1；BufferS1；BufferS2；BufferS3；BufferW1；無水乙醇的BufferW2a
(3)1×電泳緩沖液（TAE）；溴化乙錠溶液（EB）[有毒，小心]；瓊脂糖；6×加樣緩沖液
(4)酚；
(5)ddH2O；10×PCRBuffer(Mg2plus)；dNTP；M13；M13-；TaKaRarTaq酶
4方法
1.大腸桿菌感受態細胞的制備
(1)取大腸桿菌JM109保存液50μl，接種于4mlLB（或SOB）液體培養基中，37℃，300rpm振蕩培養過夜，第二天取50μl轉接到新的4mlLB（或SOB）液體培養基中擴大培養3h至OD600=0.35～0.4，在無菌操作臺上取1ml菌液于1.5ml離心管中，冰浴10min。
(2)4℃，5000rpm離心2min，去上清液。
(3)加入750μl預冷的0.1MCaCl2重懸菌體，冰浴30min。
(4)4℃，5000rpm離心2min，棄上清液。
(5)加入100μl冰冷的0.1MCaCl2輕輕重懸菌體，冰浴2h后，4℃保存備用。
2.重組DNA的轉化
(1)將含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃預熱。
(2)于100μl感受態細胞中加入10μl連接產物，冰浴30min。
(3)將離心管轉入42℃水浴，熱沖擊90秒，然后不要搖動離心管，迅速將其放在冰上2min。
(4)在離心管中加入SOC培養基300μl，槍頭混勻，37℃、150rpm溫和搖振60min。
(5)將200μl轉化菌液均勻地涂布于含50mg/mlAmp、20mg/mlX-gal、200mg/mlIPTG的LB平板上，37℃倒置培養過夜，挑選白色菌落進行鑒定。
注意事項：
①制備感受態細胞的全部操作均須于冰浴操作，同時注意近火無菌操作，防止感受態細胞受雜菌污染。
②42℃熱處理時很關鍵，轉移速度要快，且溫度要準確。
③菌液涂皿操作時，應避免反復來回涂布，因為感受態細菌的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉化率。
3．重組質粒的鑒定
方案一菌落PCR
(1)制備PCR混合液：
(2)用經滅菌的10μl槍頭（不用牙簽）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。
(3)蓋上離心管得蓋子，在沸水上溫育10min。
(4)將步驟⑶的樣品冷卻至室溫，離心數秒，然后于管中加入TaKaRarTaq酶0.25ul。
(5)按以下條件進行PCR反應：94℃預變性3min；然后進行30個循環反應，其溫度循環條件為：94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min；循環結束后72℃再延伸5min。
(6)取5μlPCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。
方案二質粒PCR
1.堿裂解法少量制備質粒DNA
(1)用離心管收集4ml在LB培養基（含Amp）中培養過夜的菌液，14000rpm離心30秒，棄盡上清。
(2)用250μl已加入RNaseA1的BufferS1充分懸浮細菌沉淀。
(3)加入250μlBufferS2，溫和但充分地上下翻轉混合4-6次，此步驟不宜超過5min。
*BufferS2使用后應立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率。
(4)加入400μlBufferS3，溫和地上下翻轉8-10次，室溫靜置2min，14000rpm離心10min。
*若離心后凝結塊未沉淀到離心管底部，應再上下翻轉數次，12000g離心3min。
(5)將DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，將步⑷中的混合液移入DNA-prepTube中，5500rpm離心1min。
(6)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入500μlBufferW1，5500rpm離心1min。
(7)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700μl已加無水乙醇的BufferW2，5500rpm離心1min，以同樣的方法再用700μl已加無水乙醇的Buffer
W2洗滌一次。
(8)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，14000rpm離心1min。
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