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免疫組化操作步驟及抗原修復(fù)（供參考）

發(fā)布時間：2022/9/15 10:26:59      閱讀次數(shù)：3162

 一、免疫組化操作步驟

（一）、儀器設(shè)備

1、 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐

2、 水浴鍋

（二）、試 劑

1、 PBS緩沖液（pH7.2―7.4）

2、 0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,pH6.0,1000ml）

3、 3%甲醇―H2O2溶液：用30% H2O2 和80%甲醇溶液配制

4、 風(fēng)裱劑：

a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0–9.5）等量混合

b. 油和TBS（PBS）配制

5、 TBS/PBS pH9.0–9.5，適用于熒光纖維鏡標(biāo)本；pH7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本

（三）、操作流程

1、 脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘

a. 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后在浸泡10分鐘

b. 無水乙醇中浸泡五分鐘

c. 95%乙醇中浸泡五分鐘

d. 75%乙醇中浸泡五分鐘

2、 抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片

二、抗原修復(fù)（免疫組化石蠟切片）

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復(fù)。

福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結(jié)構(gòu)，蛋白多肽發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致部分抗原表位封閉，結(jié)合位點減少，所以需要抗原修復(fù)，以暴露原來的抗原表位，達到充分顯露抗原，以不出現(xiàn)明顯脫片現(xiàn)象為佳。

抗原修復(fù)的幾種常用方法（供參考）

1、 微波爐加熱：

在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復(fù)1-2次。根據(jù)玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法”3分鐘溫火沸騰后靜止5分鐘，再溫火沸騰3分鐘即可。

適用的抗原：來源于人、大鼠、小鼠的組織標(biāo)本；來源于其他動物種屬的組織標(biāo)本。

2、 沸熱修復(fù)：

電爐或水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。

3、 高壓熱修復(fù)：

在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。（骨及軟骨組織的標(biāo)本最好選擇較溫和的微波加熱修復(fù)） 。

4、 酶消化方法：

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃，消化時間約為5-30分鐘。

適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。

三、石蠟切片免疫組化染色步驟

1、三步法（以SP試劑盒為例）

- 石蠟切片脫蠟至水

- 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如果采用抗原修復(fù)，可在此步后進行

- 3% H2O2 室溫孵育5~10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次

- 5~10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜

- PBS沖洗，2分鐘×3次

- 滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗，2分鐘×3次

- 滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘

- PBS沖洗，2分鐘×3次

- 顯色劑顯色（DAB或AEC）

- 自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明、封片

- 如果必要，可選用avdin封閉內(nèi)源性生物素

2.SABC法

- 脫蠟、水化

- PBS洗2次各5分鐘

- 用蒸餾水或PBS配制新鮮的3% H2O2 ，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次

- 抗原修復(fù)

- PBS洗5分鐘

- 滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體

- 滴加Ι抗50ul,室溫靜置1小時或4℃過夜或37℃1小時

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘

- PBS洗3次各2分鐘

- 滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘

- PBS洗4次各5分鐘

- DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色

- 脫水、透明、封片、鏡檢

四、冰凍切片的免疫組化染色步驟

- 速凍組織

- 冰凍切片4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內(nèi)，或進行短暫預(yù)固定后儲存于-20℃冰箱

- 室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式

- PBS沖洗，5分鐘×3次

- 用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性

- PBS沖洗，5分鐘×3次

- 下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）


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