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免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(diǎn)（供參考）

發(fā)布時(shí)間：2022/9/15 10:27:27 閱讀次數(shù)：1388

一、抗原熱修復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系

我們?nèi)粘９ぷ髦兴褂玫慕M織固定液福爾馬林會(huì)引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過程如下：

第一步：基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物；

第二步：基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞甲基橋。

上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個(gè)最關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間，有人將這兩種因素對(duì)抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式：抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度（T） × 加熱時(shí)間（t）。

也就是說當(dāng)我們修復(fù)時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就越長；反過來當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關(guān)系從MBI單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果“表1”中也可以清楚地看出。

表1 時(shí)間和溫度對(duì)染色的影響

時(shí)間（分鐘）
100℃
80℃
60℃
5×2
+ + +
―
―
5×6
+ + + +
+ + +
―
5×10
―
+ + + +
+
10小時(shí)
―
―
+ +

如果修復(fù)強(qiáng)度不夠，免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會(huì)非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽性結(jié)果，充其量只能起到定性的作用，不能適應(yīng)今后對(duì)免疫組化進(jìn)行定量的需要。這就給我們?cè)\斷中定量指標(biāo)的應(yīng)用帶來困難，例如用來測定耐藥的指標(biāo)。

二、組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系

大量的實(shí)驗(yàn)表明，固定時(shí)間越長的標(biāo)本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長，組織中蛋白對(duì)溫度的耐受也相應(yīng)增高，這可能就是我們對(duì)固定時(shí)間長的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)。

這就提醒我們?cè)谧龌仡櫺缘难芯繒r(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件，它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長修復(fù)的時(shí)間或提高修復(fù)所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結(jié)果。

三、不同pH值抗原修復(fù)液對(duì)染色結(jié)果的影響

抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液pH值也會(huì)對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。

pH值對(duì)染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況：

A.穩(wěn)定型，pH值對(duì)染色結(jié)果影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等；

B.V型，高pH值和低pH值染色較好，而pH值4-5染色結(jié)果較差，如ER、Ki-67等；

C.上升型，隨著pH值的增加，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng)，如HMB45等；

D.下降型，隨著pH值的增加染色結(jié)果逐漸減弱，當(dāng)然這種類型的抗體只是個(gè)別的現(xiàn)象，如MOC31。

一個(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高pH值都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高pH值得修復(fù)液，如1mMEDTA, pH8.0或pH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使用pH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實(shí)際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高pH值得修復(fù)液來代替目前廣為使用的pH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗(yàn)證，絕大多數(shù)的抗體使用pH9.0得修復(fù)液效果都要優(yōu)于pH6.0的枸櫞酸，尤其是核陽性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用高pH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢(shì)。

四、抗原熱修復(fù)的手段

表2 微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)的比較