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雙歧桿菌屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒

發布時間：2023/3/6 10:09:44 閱讀次數：302

CAT#:15-33900

低溫運輸，-20℃保存

雙歧桿菌屬通用探針法熒光定量 PCR 試劑盒

Bifidobacterium Probe qPCR Kit

使用手冊V1.0

產品及特點

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是一類存在于人體中非常重要的專性厭氧菌，

于1899 年首先在母乳喂養的健康嬰兒糞便中發現并分離，研究證實雙歧桿菌具

有平衡腸道菌群、降膽固醇、延緩衰老及抗腫瘤等生理功能，是人體益生菌群的

主要組成。添加雙歧桿菌的微生態制劑開發研究已成為一大熱點，廣泛應用于食

品、保健和醫療等領域。但不斷有報道指出國內外市場上雙歧桿菌微生態制劑標

示名稱混亂，很多國家市場上雙歧桿菌制品假冒代替現象嚴重。本產品就是以探

針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測雙歧桿菌屬的通用試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據雙歧桿菌屬高度保守區設計，不會跟其他微生物的DNA發生交叉反應。

5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。

6. 本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應。

7. 本產品只能用于科研。

格及成分

成分	編號	五孔包裝
2×Probe qPCR MagicMix	190303	500μL
熒光 PCR 專用模板稀釋液	180701	1ml
純凈水	100935	1ml
雙歧桿菌屬通用探針法 qPCR引物-探針混合液	15-33900yp	150μL
雙歧桿菌屬通用探針法 qPCR 陽性對照(1×10E7 拷貝/μL)	33900pc	50μL
使用手冊	15-96308sc	1份

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。

自備試劑

樣品DNA。雙歧桿菌屬通用探針法熒光定量 PCR 試劑盒

使用方法

一、稀釋標準曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。

2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。

3. 在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

7. 如果有N個樣品待提取，最好設置N+2個提取，多出的是PC（樣品制備陽性對照）和NC（樣品制備陰性對照）。可以取陽性對照的1000倍稀釋液10μL再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規定體積一致，以此作為PC。另外用水作為NC。

8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數DNA提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成分/每管	樣品管 N+2個	PCR陰性對照管	標準曲線樣品管（1-6管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	10 μL
雙歧桿菌屬通用探針法qPCR引物-探針混合液	3 μL	3 μL	3 μL
N+2個待測DNA模板	7 μL	-	-
純凈水	-	7 μL	-
第6步所得標準曲線樣品稀釋液（1-6號）	-	-	7 μL（1號樣到1號管，2號樣到2號管…）

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	10 min
PCR反應（45個循環）	95℃	15 sec
PCR反應（45個循環）	60℃	60 sec（采集FAM通道的熒光信號）

四、數據處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品核酸濃度的log值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于36。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于36則為陽性。如果在36-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。