四環(huán)素類檢測試劑盒使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）

1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜、雞蛋等樣本中的四環(huán)素類藥物（Tetracyclines，TCs），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的四環(huán)素類藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗四環(huán)素類藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含四環(huán)素類藥物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中四環(huán)素類藥物的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：37℃，30min～30min～15min

2.3 檢測下限：

組織、肝臟、雞蛋…………………2ppb

蜂蜜…………………………………2ppb

尿樣………………………………0.5ppb

牛奶…………………………………2ppb

奶粉…………………………………4ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

四環(huán)素………………………………100%

土霉素………………………………107%

金霉素………………………………16.7%

強力霉素……………………………4.2%

 2.5 樣本回收率：

組織、肝臟、雞蛋…………75±20%

蜂蜜…………………………80±20%

尿樣…………………………80±20%

牛奶、奶粉…………………75±20%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板………………………96孔

高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液1瓶：（1ml/瓶）1.0ppm（高標(biāo)準(zhǔn)液有揮發(fā)性，需注意密封）

標(biāo)準(zhǔn)品溶液0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb（均為空瓶子，現(xiàn)配現(xiàn)用）。

酶標(biāo)記物（紅蓋）……………………11ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）…………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml 四環(huán)素類檢測試劑盒使用說明書

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

5×復(fù)溶液（黃蓋） …………………50ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：濃鹽酸、無水甲醇

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：復(fù)溶液

將5×復(fù)溶液用去離子水5倍稀釋（1份5×復(fù)溶液加4份去離子水），用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液2：工作洗滌液

    將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。配液3：樣本提取液

取4.3mL濃鹽酸加去離子水混勻，定容至50mL，再加入450ml無水甲醇。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織、肝臟、雞蛋樣本處理方法

1）準(zhǔn)確稱取1±0.05g均質(zhì)后的樣本于離心管中，加入2ml 樣本提取液（配液3），劇烈振蕩2min，使樣本徹底分散，充分與有機相接觸，室溫4000轉(zhuǎn)/分以上，離心5min；

2）取出50ul上層液體（樣本脂肪多最上層會有白色漂浮物，不要取到）,加入950ul復(fù)溶液混勻；

3）取50 µl用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：40    檢測下限：2ppb

5.3.2 蜂蜜樣本處理方法

1）準(zhǔn)確稱取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入1ml樣本提取液（配液3），振蕩混勻2min，使蜂蜜充分溶解；

2）取出50ul混合液,加入950ul復(fù)溶液混勻；

3）取50µl用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：40    檢測下限：2ppb

5.3.3 尿樣本的處理方法

1）用復(fù)溶液將尿樣10倍稀釋（如果尿樣渾濁一定要過濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

2）取50µl稀釋的尿樣用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.5ppb

5.3.4 牛奶樣本處理方法

1）準(zhǔn)確吸取1ml牛奶于離心管中， 加2ml樣本提取液（配液3），振蕩2min，室溫4000轉(zhuǎn)/分以上，離心5min；

2）取50ul上層液，加入950ul復(fù)溶液，混勻；

3）取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：40    檢測下限：2ppb

5.3.5 奶粉樣本處理方法

1）準(zhǔn)確稱取1±0.05g奶粉于離心管中，加入4ml樣本提取液（配液3），振蕩2min，室溫4000轉(zhuǎn)/分以上，離心5min；

2）取50ul上層液，加入950ul復(fù)溶液，混勻；

3）取50µl用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：80    檢測下限：4ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前需配制標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液；低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定，需現(xiàn)配現(xiàn)用。

在0ppb的瓶中加復(fù)溶液3ml，0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb的瓶中分別加復(fù)溶液2ml，4.05ppb的瓶中加復(fù)溶液3ml。

標(biāo)準(zhǔn)液6：取1.0ppm高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液12ul加入裝有3ml 復(fù)溶液4.05ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為4.05ppb。

標(biāo)準(zhǔn)液5：取1ml標(biāo)準(zhǔn)液6加入裝有2ml 復(fù)溶液1.35ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為1.35ppb。

標(biāo)準(zhǔn)液4：取1ml標(biāo)準(zhǔn)液5加入裝有2ml 復(fù)溶液0.45ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.45ppb。

標(biāo)準(zhǔn)液3：取1ml標(biāo)準(zhǔn)液4加入裝有2ml 復(fù)溶液0.15ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.15ppb。

標(biāo)準(zhǔn)液2：取1ml標(biāo)準(zhǔn)液3加入裝有2ml 復(fù)溶液0.05ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.05ppb。

標(biāo)準(zhǔn)液1：直接使用復(fù)溶液，濃度即為0ppb。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，37℃避光反應(yīng)30分鐘。

6.5 洗    滌：同上

6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。

6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.8 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值 四環(huán)素類檢測試劑盒使用說明書

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

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