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郁金香碎色病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

發布時間：2024/7/27 15:32:47 閱讀次數：70

郁金香碎色病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

郁金香碎色病毒
探針法熒光定量 RT- PCR 試劑盒
Tu lip b reaki ng Pot y vi rus P ro be RT - q P C R K it產品及特點

本試劑盒可用于檢測郁金香碎色病毒。郁金香碎色病毒（Tulip breaking Potyvirus ， TBV）屬馬鈴薯 Y 病毒科馬鈴薯 Y 病毒屬，只侵染郁金香屬(Tulipa spp.)和百合屬(Lilium spp.)植物，導致郁金香和百合的花瓣和葉片出現斑駁的雜色條紋，感染 TBV 的郁金香不僅表現出花色雜色，而且植株也會退化。本產品是根據探針法熒光定量 RT-PCR 原理開發的郁金香碎色病毒檢測試劑盒，它具有下列特點：
1.   即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2.   引物等組分經過優化，靈敏度高。
3.   提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
4.   特異性高，引物是根據郁金香碎色病毒 RNA 序列高度保守區設計，不會跟其他病毒的 RNA 發生交叉反應。
5.   既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數量級。
6.   本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。
7.   本產品只能用于科研。

成分規格

產品組成	編號	規格
2 × OneStep Probe Mix	021101a	550 μl
OneStep Probe Enzyme Mix	021102b	55 μl
DEPC-H2O	070401	1 ml
熒光模板稀釋液	070407	1 ml
郁金香碎色病毒 RT-qPCR 引物-探針混合液	1525190yp	210 μl
郁金香碎色病毒 RT-qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL)	1525190pc	50 μl

保存條件

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽性對照需要單獨放置，不要污染其他試劑。
郁金香碎色病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
使用方法
一、RNA 提取(樣本制備區)
用自選方法提取純化樣品 RNA，本試劑盒跟市場上大多數核酸提取試劑盒兼容。建議使用病毒基因組 DNA/RNA 提取試劑盒（Cat:GZ010702-50）提取 RNA。
二、稀釋標準曲線樣品(樣本制備區)
（由于陽性對照濃度高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，避免污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1.    標記 6 個離心管，分別為 7 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2。
2.    用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光模板稀釋液，（最好用帶芯槍頭，下同）。
3.    在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.    換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.    換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.    重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。若無需制作標準曲線，將陽性對照稀釋到 1×10E5 拷貝/μL 即可。
三、試劑配制(試劑準備區)
若有 N 個待檢樣品，準備 N+2 個 qPCR 管(N 個待檢樣品+1個陰性對照+6 個陽性對照) ，向各 qPCR 管中分別加入下列成分。

成分	樣品管 N+2 個	qPCR 陰性對照	qPCR 陽性對照
2 × OneStep Probe Mix	各 10 μL	10 μL	10 μL
OneStep Probe Enzyme Mix	各 1 μL	1 μL	1 μL
郁金香碎色病毒 RT-qPCR 引物-探針混合液	各 4 μL	4 μL	4 μL

郁金香碎色病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
轉移至樣本準備區。
四、添加模板(模板添加區)
向 qPCR 管中分別加入 5 μl 模板，順序為陰性對照（DEPC-H2O）、待測樣品模板、郁金香碎色病毒 RT-qPCR 陽性對照，離心 30 秒，立即進行擴增反應。
五、擴增反應(擴增及產物分析區)
將 qPCR 管放置在 qPCR 擴增儀器樣品槽相應位置，進行擴增，擴增程序如下：

過程	溫度	時間
逆轉錄	50℃	20 min
預變性	95℃	3 min
qPCR 反應（45 個循環）	95℃	15 sec
qPCR 反應（45 個循環）	60℃	20 sec
信號通道	FAM 通道采集熒光信號

六、結果分析
1. 如果制作標準曲線，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，推算出其濃度。
2. 如果未制作標準曲線，按照如下標準判定結果：
陽性對照（1×10E5 拷貝/μL）結果：Ct 值<30 ，有明顯指數增長，呈典型的 S 型曲線。
陰性對照結果：Ct 值>40 或無 Ct 值，無明顯指數增長期和平臺期。
樣本檢測結果：Ct 值<38 ，有明顯指數增長，表明樣本中檢測出該病毒，結果為陽性；Ct 值>40 或無 Ct 值，表明樣本中未檢測出該病毒，結果為陰性；Ct 值在38-40 范圍，應對樣本進行復檢，如重復實驗結果 Ct 值仍在 38-40 范圍，有明顯指數增長，則判定為陽性，否則為陰性。

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