售后時常常會收到老師同學(xué)反饋細(xì)胞養(yǎng)得好好的，生長狀態(tài)不錯、形態(tài)還非常好，但凍存過后再復(fù)蘇后細(xì)胞就開始不貼壁了。這其中涉及的因素過多，這篇這里先就整理一部分原因
原因總結(jié)
01凍存液質(zhì)量過次
凍存細(xì)胞時使用于凍存的溶液質(zhì)量過次。無論甘油還是DMSO ，質(zhì)量都是非常重要，質(zhì)量過次導(dǎo)致細(xì)胞在凍存過程中死亡02凍存細(xì)胞長時間在常溫下
放入凍存液的細(xì)胞長時間暴露在常溫下。DMSO作為實(shí)驗(yàn)室常用于配置細(xì)胞凍存液的關(guān)鍵凍存試劑，在低溫條件下可以起到保護(hù)細(xì)胞的作用，但在常溫下對細(xì)胞有毒性。如果長時間暴露在常溫下，就會導(dǎo)致細(xì)胞全部凋亡。這就是為什么講究“速溶“的原
03凍存時間把控出錯
程序凍存細(xì)胞時間把控出現(xiàn)錯誤。實(shí)驗(yàn)室常配置的細(xì)胞凍存液都需要進(jìn)行一段程序降溫才能移入液氮保存，這一段程序時間較長，容易遺忘將正在進(jìn)行凍存的細(xì)胞時間導(dǎo)致進(jìn)入液氮前的程序凍存時間過長或過短，讓凍存過程中的細(xì)胞狀態(tài)受損。
04配置比例出錯
配置的凍存試劑的比例錯誤。DMSO是目前最常用的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，一般使用時終濃度控制在5~10%，最佳濃度取決于細(xì)胞類型。一般來說，存活率比較高的細(xì)胞系，培養(yǎng)基、血清、DMSO按照7：2：1的比例新鮮配制使用。比例過多或少都會導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)受損。05細(xì)胞狀態(tài)過差
凍存前細(xì)胞是否受過污染或狀態(tài)不好。凍存操作本身就是對細(xì)胞有損傷的，如果凍存前細(xì)胞狀態(tài)不行，經(jīng)過凍存復(fù)蘇后狀態(tài)只會更差，出現(xiàn)大量的死細(xì)胞。凍存細(xì)胞前要確保細(xì)胞狀態(tài)較好并有一定的細(xì)胞量才可以進(jìn)行凍存操作。
06凍存液未混勻
配置的凍存液未混勻。配置的凍存液未混勻也會導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差，有影響但不會太大。
07凍存時間把控出現(xiàn)錯
程序凍存細(xì)胞時間把控出現(xiàn)錯誤。實(shí)驗(yàn)室常配置的細(xì)胞凍存液都需要進(jìn)行一段程序降溫才能移入液氮保存，這一段程序時間較長，容易遺忘將正在進(jìn)行凍存的細(xì)胞時間導(dǎo)致進(jìn)入液氮前的程序凍存時間過長或過短，讓凍存過程中的細(xì)胞狀態(tài)受損。08細(xì)胞消化時間過長
細(xì)胞消化時間過長。對，又是細(xì)胞消化步驟，它不僅是貼壁細(xì)胞傳代的必要步驟，而且也是貼壁細(xì)胞凍存的必要步驟。于傳達(dá)不同是傳代完成后培養(yǎng)就可以看到細(xì)胞是否在消化時出現(xiàn)問題，而凍存是需要復(fù)蘇后培養(yǎng)才歸為凍存失敗的一點(diǎn)。09細(xì)胞密度過大
細(xì)胞密度過于密或未將細(xì)胞團(tuán)吹開。由于細(xì)胞在凍存時只有大約1ml凍存溶液空間，且凍存也需要很長的時間，很容易造成細(xì)胞堆積過多過久導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
以上是貼壁細(xì)胞凍存復(fù)蘇后細(xì)胞不貼壁的部分原因，更多原因可在留言交流討論。
