最初養細胞的時候看著師兄全副武裝進入細胞房是一件很神圣的事情。。。
時間長了才發現，養細胞是一件痛苦并快樂的事情，要像對待小baby一樣照顧它、呵護它，細胞長的好心情就會像飛起來，細胞出現一點點狀況，心情就會跌入谷底。下面將小編多年養細胞的經驗、心得與注意事項與大家交流一下。
一般來說，影響細胞培養的因素有很多，下面我們分為幾個小專題和大家分享一下。
1.血清篇2.添加劑篇3.細胞傳代篇
4.細胞凍存篇5.細胞污染篇6.原代細胞篇
血清篇
血清的熱滅活：
滅活方法：56℃滅活30min。滅活后，血清的外觀會發生變化，沉淀物顯著增多。熱滅活主要是滅活補體系統，因為激活的補體系統會激活淋巴細胞和巨噬細胞。原代細胞和免疫細胞建議熱滅活血清。
血清的沉淀：
血清沉淀主要是血清中的各種蛋白、磷酸鈣和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白、玻連蛋白等）引起，不會影響血清質量，使用時可以2000rpm
離心5分鐘，取上清使用。
可能會增加血清沉淀的操作：1、熱滅活；2、37℃培養；3、反復凍融；4、伽馬射線照射；5、2-8℃長期保存；6、長期保存于可自動化霜的冰箱中（溫度不穩定）。
血清保存：
建議血清保存于-20℃冰箱中，分裝使用，如果存放在4℃，請勿超過一個月。
血清的選擇：
血清為細胞的繁殖提供必須的生長因子，同時也是礦物質、脂類及激素的來源。最常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和馬血清等。牛血清是按照采血時間的早晚來分類的。采血時間越早，營養物質越豐富，所含抗體也越少，因而胎牛血清適合要求高的細胞系和克隆化培養。 血清批次間的差別是不可避免的，建議您一旦選定了某個批次的血清，最好備貨，避免以后的麻煩。
添加劑篇
平衡鹽溶液
平衡鹽溶液主要是由無機鹽、葡萄糖組成；它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定及提供簡單的營養；同時用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。
PBS磷酸鹽緩沖液： (Phosphate-Buffered Saline)，含135mM NaCl, 4.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4，pH值為7.4，經過滅菌處理。
用途：用于細胞培養過程中細胞的洗滌或其他常規用途。
D-PBS：D-PBS溶液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)，含2.67mM KCl, 1.47mM KH2PO4, 137.93mM NaCl, 8.06mM Na2HPO4，pH值為7.4，經過滅菌處理。
用途：不含鈣、鎂離子，多用于胚胎學方面的研究，常用于胚胎的沖洗液，凍存液和培養液。
Hank’s平衡鹽：Hanks' Balanced Salt Solution，簡稱HBSS，含137.93mM NaCl, 5.33mM KCl, 4.17mM NaHCO3, 0.441mM KH2PO4, 0.338mM Na2HPO4, 5.56mM D-Glucose。經過無菌處理。
用途：可用于在大氣環境下維持細胞生理 pH 的緩沖液，用于細胞培養過程中細胞的洗滌等常規用途。
緩沖液
絕大多數細胞的最佳生長條件是pH 6.8-7.8。多數培養基利用碳酸氫鈉進行緩沖，碳酸氫鈉的緩沖需要二氧化碳。 NaHCO3溶液：7.5% NaHCO3溶液(Sodium Bicarbonate Solutioin)用水配制，已經過過濾除菌。
用途：常用于細胞培養過程中調節培養基pH值。
細胞傳代篇
胰酶消化細胞：
a.吸去培養液，用無菌的PBS、Hanks液或無血清培養液洗滌細胞一次，以去除殘余的血清。
b.加入少量胰酶細胞消化液，略蓋過細胞即可，室溫放置30秒至2分鐘。不同的細胞消化時間有所不同。
c.顯微鏡下觀察，細胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養器皿底部發現細胞的形態發生明顯的變化；或者用槍吹打細胞發現細胞剛好可以被吹打下來。此時吸除胰酶細胞消化液。加入含血清的完全細胞培養液，吹打下細胞，即可直接用于后續實驗。
d.如果發現消化不足，則加入胰酶細胞消化液重新消化。
如果發現細胞消化時間過長，未及吹打細胞，細胞已經有部分直接從培養器皿底部脫落，直接用胰酶細胞消化液把細胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘，沉淀細胞，盡量去除胰酶細胞消化液后，加入含血清的完全培養液重新懸浮細胞，即可用于后續實驗。
對于比較難消化的細胞，比如結腸癌細胞HCT116，HCT15，KM12，這些細胞一般需要少量的胰酶孵育，以恰好覆蓋細胞為宜，時間在5min左右，細胞呈流沙狀移動，即可終止消化。對于難消化的細胞，一般在trypsin中添加一些EDTA。
細胞凍存篇
細胞凍存遵守慢凍速融原則。細胞在凍存時，細胞冷到0℃以下，細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞中形成冰晶，大的冰晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂，因此需要慢凍，防止大的冰晶產生；快融是防止小冰晶重結晶形成大冰晶。常用的低溫保護劑是DMSO，是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高細胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，使水滲透到細胞外形成冰晶。細胞凍存液主要成分是高糖DMEM、適量澳洲進口優質胎牛血清及DMSO。
細胞凍存步驟：胰酶消化細胞--吹打成細胞懸液--離心獲取細胞沉淀--添加凍存液--程序性降溫凍存細胞--做好凍存記錄。
注意事項：1、0至-60℃是低溫損傷發生的主要溫度范圍，被稱為“危險溫區”，細胞短暫放置后應立刻轉移到-80℃，長期保存需要轉移到液氮罐中，并定期檢查液氮罐，及時添加。
細胞污染篇
養細胞最頭痛的就是遇到污染問題，總是讓你猝不及防，又無從尋找原因。現整理一些細胞培養過程中常遇見的污染問題，供君參考。
細胞污染根據污染源的不同主要分為3類：化學性污染、物理性污染和微生物污染，其中微生物污染是最常見也是最嚴重的，一旦發生，無法挽救，只能將細胞丟棄。下面簡單介紹一下常見的微生物污染。
霉菌污染：霉菌污染種類很多，多為曲霉菌、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
污染源：實驗人員（實驗服）
霉菌污染后短期內不會引起培養液的渾濁，會在培養液中形成白色或淡黃色漂浮物，一般肉眼可見，易被發現。4d左右倒置顯微鏡下可以觀察到縱橫交錯的菌絲。
酵母污染更容易觀察，培養物變渾濁，顯微鏡下可以觀察到卵圓形或球形顆粒，散在細胞上及細胞周邊生長，有些會芽生較小顆粒。
確認是霉菌污染后，需要將細胞直接丟棄，將實驗環節徹底消毒處理。
細菌污染：
常見的細菌污染主要是大腸桿菌、假單胞菌、 葡萄球菌等，其中革蘭陽性菌較為多見。
污染源：操作不當或是器材消毒不嚴，或是各種營養成分隱性污染細菌沒有被檢測出來所造成的。
污染速度快，多數情況下細胞培養液短時間內變黃，pH值降低，明顯渾濁，倒置顯微鏡下觀察，細胞漿出現大量顆粒，細胞變圓或崩潰，從壁上脫落，細胞培養液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，呈細沙狀，細胞間可以觀察到菌體存在。必要時可以取少量培養液接種到細菌培養板或細菌培養基中培養、檢測。一旦發生細菌污染，早期時可以增大雙抗的使用倍數，用藥24-48小時后更換成常規培養基，污染晚期，細胞需要棄掉，復蘇新的細胞。
支原體污染：
污染源：血清
大小介于細菌與病毒之間的無細胞壁的原核細胞，對抗生素不敏感，可穿過0.22 μm 的孔徑濾膜，不能用肉眼或光學顯微鏡檢測，在細胞培養過程中是最容易忽視的一類污染。
支原體污染早期，細胞沒有明顯的變化，只有污染嚴重后，細胞增殖速度降低，細胞脫落。并且支原體可以通過移液、傾倒液體時產生具有潛在感染力的飛沫和吸附的塵埃，沉積在物體表面，污染操作環境，引起交叉感染和再次污染。懷疑支原體污染，可以使用支原體檢測試劑盒進行檢測。
污染較輕時，使用支原體去除試劑盒進行處理
同時嚴格清理實驗操作環境。
ps:從外部獲取的細胞請記得要進行支原體污染檢測呦！
黑膠蟲污染：
黑膠蟲是學術界爭議比較大的一類污染，不能確定是生物還是非生物，可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播。
污染源：血清
開始污染時對細胞無影響，當達到一定數量時會抑制細胞生長，培養基沒有變化，顯微鏡下可以觀察到點狀或片狀游動小體。細胞增殖旺盛之后會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。
病毒污染：
病毒污染不會影響細胞的傳代培養，但生產疫苗是不安全的。
污染源：動物血清或者細胞系，常見于雜交瘤細胞。
病毒污染極為隱蔽，很難檢測。細胞液沒有變化，大多數受病毒污染的細胞也不會產生形態變化及細胞病理現象，僅有少部分病毒會造成細胞變圓、腫脹，脫落。 懷疑發生病毒污染可以用血細胞吸附試驗、免疫熒光抗體法及電子顯微鏡法有效檢出病毒。通常病毒污染的清除是十分困難的，可以重新引入高質量的細胞株。
非同種細胞污染：
即細胞交叉污染，由于在培養過程中各種細胞同時進行，而所用器具或液體混雜使用所致。細胞發生交叉污染后由于難以分離細胞，所以一般是丟棄細胞，重新獲取實驗所需細胞。 所以在吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。
原代細胞篇
注意事項：
原代細胞是剛從體內取出的組織中獲得的細胞，要求不嚴格的話，十代以內都算原代細胞。因為離體時間短更能接近體內狀況，同時對體外培養條件更加苛刻，需要更接近體內環境培養條件。
1、計數前，注意吸盡平皿里的細胞，充分混勻，使細胞分散成單個細胞，每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染。
2、原代細胞未經永生化處理，因此群體倍增次數有限。為了防止遺傳上的變化，最好盡快開始做實驗。另外，為了防止混入雜細胞比例的增加，要經常觀察細胞形態。
3、原代細胞再凍存后，細胞會老化，也可能引起機能變化，所以不建議凍存。細胞凍存也是細胞死傷的主要原因。
4、如果DMSO的濃度足夠低，不會對細胞造成傷害，復蘇原代細胞建議用帶有血清的完全培養基溶解后鋪瓶，第二天換液去除DMSO。
5、原代細胞傳代時，要用低濃度的胰酶消化，在顯微鏡下看到細胞開始變圓、脫落后迅速終止胰酶。建議采用含10%血清的完全培養基作為胰酶終止劑終止消化。
