[細(xì)胞因子概述]

細(xì)胞因子(Cytokine)是一類由免疫細(xì)胞(如單核、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等)和某些非免疫細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等)在受到刺激后合成和分泌的小分子蛋白質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性。

細(xì)胞因子分為促炎性和抗炎性兩種。細(xì)胞因子具體分類請參考免疫學(xué)基礎(chǔ)知識(九)：細(xì)胞因子概述

促炎細(xì)胞因子由Th1細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌，包括有IL-1(IL-1α、IL-1β)、IL-2、IL-6、IL-8、IL-11、IL-12、IL-17、IL-18、IL-33、LIF、OSM、CNTF、TGF-β、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α。

關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子是IL-1(IL-1α、IL-1β)、IL-6和TNF-α。

這些促炎細(xì)胞因子通過I型細(xì)胞因子受體(CCR1)發(fā)出信號，該受體在結(jié)構(gòu)上與其他細(xì)胞因子受體類型有所不同。它們緊密調(diào)節(jié)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。

促炎細(xì)胞因子通常調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的生長、活化、分化以及歸巢至感染部位，最終控制并根除細(xì)胞內(nèi)病原體(包括病毒)。

抗炎細(xì)胞因子是一系列控制促炎細(xì)胞因子反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)分子，細(xì)胞因子與特定的細(xì)胞因子抑制劑和可溶性細(xì)胞因子受體協(xié)同作用以調(diào)節(jié)人體免疫反應(yīng)，抗炎細(xì)胞因子在炎癥中的生理作用和在全身性炎癥狀態(tài)中的病理作用被廣泛認(rèn)可。

關(guān)鍵的抗炎細(xì)胞因子包括IL-1受體拮抗劑、 IL-4 、 IL-10 和 IL-13。

表 1.細(xì)胞因子及其功能概述

[細(xì)胞因子檢測技術(shù)]

目前檢測細(xì)胞因子的方法有很多，根據(jù)檢測原理和手段的不同，檢測技術(shù)大致包括免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法及質(zhì)譜法。

基于免疫學(xué)的檢測方法：炎癥因子作為一種蛋白質(zhì)抗原，可以特異性與其單克隆抗體結(jié)合，利用抗原-抗體反應(yīng)檢測細(xì)胞因子，近年來發(fā)展比較快，其方法包括Western Blot、IF、ELISA、FCM、CBA、ELISpot、MSD技術(shù)、Luminex技術(shù)、Olink技術(shù)、Simoa技術(shù)等。

基于分子生物學(xué)方法：主要是檢測細(xì)胞因子的基因表達水平，包括對其DNA的檢測和mRNA表達水平的檢測。對于表達低或者體內(nèi)只能得到數(shù)量極少的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，因其含量太低，免疫學(xué)和生物學(xué)方法難以測定，常用的方法有Southern印跡、斑點印跡、PCR，原位雜交及原位PCR等，Northern印跡及RT-PCR。

1、Western Blot (WB)

Western Blot (WB)是一種熟知的蛋白質(zhì)印跡法/免疫印跡實驗，是一種常規(guī)的蛋白分析技術(shù)，常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。

WB實驗的基本核心理念是抗原-抗體的特異性反應(yīng)，通過變性膠SDS-PAGE將不同分子量的蛋白質(zhì)分離開，然后轉(zhuǎn)移到固相載體硝酸纖維素薄膜(NC)或聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上，再用脫脂牛奶作為封閉液進行封閉和一抗稀釋液進行稀釋。待目的蛋白和抗體充分結(jié)合后，用洗脫液洗脫掉多余未結(jié)合的一抗，加入帶有標(biāo)記的對應(yīng)二抗，這樣，目的蛋白+一抗+二抗形成一個復(fù)合物，加以化學(xué)發(fā)光液，有靶蛋白的位置就會產(chǎn)生熒光，利用膠片或者化學(xué)發(fā)光儀就可以顯現(xiàn)靶蛋白的條帶顯現(xiàn)。

WB有現(xiàn)成試劑盒，使用者只需要按照試劑盒的操作步驟完成即可，其特異性、重復(fù)性及精密性較好，可實現(xiàn)pg級別的絕對定量。

WB可用于蛋白質(zhì)表達水平的測定、細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和翻譯后修飾等研究，可實現(xiàn)蛋白的定性和相對定量(半定量)，而且可以看到蛋白的分子量大小。只要抗體可用，該方法可廣泛應(yīng)用于人、動物、植物等多個物種的研究中。

本質(zhì)原理上ELISA和WB都可以，但炎癥因子作為蛋白質(zhì)，存在濃度級的問題，太低了檢測不到，或者不能真實反映，所以細(xì)胞分泌的炎癥因子一般不能用來跑WB。

2、全自動毛細(xì)管 Digital Western

作為創(chuàng)新性毛細(xì)管電泳免疫學(xué)技術(shù)，全自動毛細(xì)管Digital Western(也稱Simple Western)將Western Blot技術(shù)和ELISA技術(shù)合二為一，具備傳統(tǒng)WB蛋白質(zhì)可視化定性優(yōu)勢，同時具備ELISA免疫學(xué)實驗精準(zhǔn)定量能力，其靈敏度和精密度符合高標(biāo)準(zhǔn)生物分析要求，可利用超微量樣本實現(xiàn)內(nèi)源性蛋白質(zhì)精準(zhǔn)定量。

自動化規(guī)避了傳統(tǒng)WB和SDS-PAGE勞動密集型操作引入的人為誤差，僅需要微量樣本(3 μL)即可實現(xiàn)多重蛋白質(zhì)表達檢測，節(jié)約珍貴樣品，例如，外泌體、分選干細(xì)胞、顯微切割、類器官、生殖細(xì)胞等。全程試驗無人值守，3小時即可獲取25個實驗樣品數(shù)據(jù)。可精準(zhǔn)定量，覆蓋從體外細(xì)胞水平到體內(nèi)組織水平實驗，建立藥物與蛋白質(zhì)表達水平的量效關(guān)系和時效關(guān)系曲線。

3、免疫熒光法IF

免疫熒光法(Immunofluorescence, IF)是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原/細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細(xì)胞定位。

利用激光共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)記的抗體與細(xì)胞因子結(jié)合的情況，適用于定量和定位分析。

該技術(shù)的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。

主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。

4、ELISA

酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是將抗原、抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機結(jié)合而發(fā)展起來的一種綜合性技術(shù)。

固定在載體表面的抗原或者抗體不會失活，仍然保留其免疫反應(yīng)性，酶標(biāo)記的抗體或者抗原既具有免疫學(xué)活性，還具有酶的催化活性。

在實際檢測時，首先將抗原或者抗體固定在固相載體上，然后加入檢測對象，讓待測物質(zhì)與固相化物質(zhì)結(jié)合，形成固相化的“抗原-抗體”復(fù)合物；再加入酶標(biāo)記的抗體或者抗原，與固相化的復(fù)合物結(jié)合，形成酶標(biāo)復(fù)合物，最后加入底物溶液，發(fā)生酶催化底物顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色深淺進行定性或定量分析。

ELISA有不同形式，包括直接法ELISA、間接法ELISA、夾心法ELISA和競爭法ELISA。

最常用的是夾心法ELISA，它可以直接檢測分泌到細(xì)胞外的處于游離狀態(tài)的細(xì)胞因子，靈敏度高、操作簡單、經(jīng)濟實惠，實驗室配備一臺酶標(biāo)儀就可以完成整個實驗。

5、全自動微流控 ELISA

全自動微流控免疫分析平臺克服了傳統(tǒng)ELISA技術(shù)手動操作步驟多、時間長、樣本量大、重復(fù)性差和結(jié)果不可靠等局限。

利用創(chuàng)新的微流控卡盒，全自動生物標(biāo)志物檢測平臺可快速獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)結(jié)果，同時可對多種生物標(biāo)志物進行多通道同步檢測。

其檢測原理如下圖所示，特異性捕獲抗體包被在納米級微量反應(yīng)管(Glass Nano Reactor，GNR)中，再將GNR嵌入微流控管路內(nèi)。相關(guān)的抗體對和試劑已經(jīng)被預(yù)先包被在卡盒中，并且經(jīng)過嚴(yán)格驗證，卡盒拿來即用，方便快捷。卡盒出廠內(nèi)置標(biāo)曲，無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。微流控ELISA平臺可自動取樣本和檢測，最后自動輸出2~3個平行GNR的數(shù)據(jù)及均值。

傳統(tǒng)的多重檢測可能會出現(xiàn)交叉反應(yīng)和干擾，從而降低數(shù)據(jù)質(zhì)量，而微流控ELISA可將待測樣本分配到四個平行的微流控管路中，同一管路內(nèi)最多只進行兩重檢測，從而消除交叉反應(yīng)信號串?dāng)_的問題。

6、ELISpot

酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISpot)是一種定量和定性的實驗，基于夾心ELISA免疫分析原理，旨在計數(shù)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞。它的靈敏度極高，因此在檢測低量細(xì)胞因子分泌細(xì)胞(1/300000)方面非常有效，對抗原的細(xì)胞因子釋放可以映射到單個細(xì)胞，因此可以計算T細(xì)胞應(yīng)答頻率。

細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISpot酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。該技術(shù)可以在單細(xì)胞水平對抗體分泌細(xì)胞及細(xì)胞因子分泌細(xì)胞進行檢測，能從20-30萬個細(xì)胞中檢岀1個分泌該蛋白的細(xì)胞。

該方法關(guān)注的結(jié)果是分泌細(xì)胞的比率(等于陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))，主要用于疫苗、細(xì)胞治療、基因治療等領(lǐng)域，是研究T細(xì)胞免疫原性反應(yīng)的主要檢測方法。

ELISpot通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下或通過儀器對斑點進行計數(shù)，1個斑點代表1個細(xì)胞，從而計算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。而ELISA則通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。

該方法的樣本要求是活細(xì)胞，其中細(xì)胞存活率最好不低于80%，如果能達到90%以上更好。

ELISpot法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。

7、MSD

超敏電化學(xué)發(fā)光技術(shù)(Meso Scale Discovery, MSD)是基于石墨微孔板的電化學(xué)發(fā)光免疫分析，它是根據(jù)ELISA基本原理的升級，在板底通電從而激發(fā)標(biāo)記物SULFO-TAG發(fā)光并由CCD Camera進行信號采集。

主要基于超敏多因子電化學(xué)發(fā)光分析儀MESO Sector 600或Quickplex SQ 120，通過點陣技術(shù)，在96孔石墨電極板里可實現(xiàn)10個指標(biāo)每孔的檢測，也可在24孔板里定制實現(xiàn)100指標(biāo)/孔的篩選檢測。

MSD系統(tǒng)的靈敏度略高于流式細(xì)胞儀(CBA)系統(tǒng)，可以定量自然細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、IL-12p70、IL-1β)的循環(huán)水平，并準(zhǔn)確回收添加到血清樣本中的已知數(shù)量的重組細(xì)胞因子。

MSD是一種電化學(xué)發(fā)光法，用于檢測細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)、抗體和核酸等生物分子，屬于第三代免疫分析技術(shù)。

8、Luminex液相芯片檢測技術(shù)

Luminex技術(shù)是結(jié)合微球和流式細(xì)胞儀的原理來檢測蛋白的一種方法，核心是將聚丙乙烯微球或者磁性微球用熒光染料的方法進行編碼，通過調(diào)節(jié)兩種熒光染料的不同配比獲得最多100種具有不同熒光光譜的微球，每種微球共價交聯(lián)上針對特定抗原的捕獲抗體。

應(yīng)用時，先將針對不同檢測物的微球混合，加入待測樣本后，靶分子與微球表面的捕獲抗體特異結(jié)合，每個反應(yīng)孔中可同時完成最多100種檢測反應(yīng)。上機時儀器通過兩束激光分別識別微球的編碼和微球上報告分子的熒光信號強度，熒光強度反應(yīng)微球結(jié)合的靶標(biāo)蛋白的含量，這一步用于定量。因此，利用微球技術(shù)，可以同時檢測多個蛋白。

Luminex技術(shù)類似多重ELISA檢測，也可以實現(xiàn)pg級別的絕對定量，可以檢測細(xì)胞因子、趨化因子、轉(zhuǎn)錄因子和生長因子等260多種蛋白和數(shù)以千計基因表達情況，而且一次可以檢測多種蛋白指標(biāo)。

9、PEA (Olink平臺)

臨近延伸分析技術(shù)(Proximity Extension Assay, PEA)是通過一對特異性抗體結(jié)合識別靶蛋白，這對抗體分別偶聯(lián)DNA寡核苷酸標(biāo)記，當(dāng)結(jié)合在同一蛋白上的兩個抗體相互靠近時DNA寡核苷酸互補配對并結(jié)合DNA聚合酶進行擴增。最后，使用qPCR或二代測序技術(shù)定量DNA寡核苷酸，通過特異性的核苷酸序列信號來反應(yīng)檢測蛋白質(zhì)的含量。

PEA能夠利用微量的血清、血漿或幾乎任何其他類型的生物樣本進行高通量、多重免疫檢測。

其檢測原理基于抗體免疫分析和PCR或二代測序(Next Generation Sequencing, NGS)技術(shù)，96個寡核苷酸抗體對中的每一對都包含唯一的DNA序列，只允許彼此雜交，隨后的鄰近延伸將創(chuàng)建96個唯一的DNA報告序列，這些序列將通過實時PCR進行擴增。多重免疫測定的限制因素是抗體的交叉反應(yīng)，這會將大多數(shù)測定的多重測定程度限制在10重以下。但是該技術(shù)不會檢測到交叉反應(yīng)，無串?dāng)_，因為只有匹配的DNA報告對才能夠雜交以產(chǎn)生用于NGS或?qū)崟rqPCR的擴增子，這允許進行可擴展的多重測定而不損失特異性和靈敏性。

Olink技術(shù)檢測限可達飛摩爾(fg/ml)數(shù)量級，具有高通量、高靈敏、低體積、寬動態(tài)、支持液體活檢及多樣本形式、自動化樣本處理流程提供絕佳的簡易性、準(zhǔn)確性及重復(fù)性，可用于疾病預(yù)測、病例分層、診斷及預(yù)后、篩選疾病標(biāo)志物、藥物靶點等基礎(chǔ)研究。

10、單分子免疫陣列技術(shù) SiMoA

單分子免疫陣列技術(shù)(Single Molecule Array, SiMoA)基于微陣列芯片單分子免疫檢測，是在毫米級芯片上雕刻(或澆筑)成千上萬個微米級微井，每個微井體積約40 fl左右，隨后將免疫復(fù)合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率熒光顯微鏡對熒光點進行計數(shù)，依據(jù)泊松分布理論，計算同時含Bead與熒光產(chǎn)物孔的數(shù)量/含Bead孔總數(shù)的比值，以此確定測試樣品中的蛋白質(zhì)濃度。

其原理就像是在一個微小的反應(yīng)容器(微井)中放大信號，微井把待測物和檢測抗體捕捉在一個特定區(qū)域內(nèi)，形成一種單分子級別的反應(yīng)環(huán)境。這個微小的反應(yīng)容器不僅能夠隔離待測物，還能夠增強信號，使能夠觀察到微小到單分子水平的事件。當(dāng)目標(biāo)分子與檢測抗體結(jié)合時，引入熒光或其他標(biāo)記物，產(chǎn)生可觀測的光信號。單分子免疫陣列技術(shù)的靈敏度非常高，能夠檢測到極低濃度的分子，使得對罕見或微量分子的檢測成為可能。

SiMoA技術(shù)靈敏度高，與Olink技術(shù)同為目前具代表性的單分子免疫檢測技術(shù)。實現(xiàn)了超低豐度蛋白的有效檢測和定量，為低豐度炎癥因子的實時監(jiān)控提供了技術(shù)支撐，專注于神經(jīng)、免疫&腫瘤、心臟病、傳染病、炎癥等生物標(biāo)記物檢測應(yīng)用領(lǐng)域。

11、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)胞內(nèi)染色法

細(xì)胞因子是由細(xì)胞合成和分泌的，ELISA只檢測分泌到細(xì)胞外的細(xì)胞因子，新合成的細(xì)胞因子怎么檢測呢？流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法(Flow cytometry intracellular staining)便可以做到。

通常情況下，獲得需要的單細(xì)胞懸液后，經(jīng)激活和通透處理之后，達到胞內(nèi)染色檢測細(xì)胞因子的濃度閾值，進行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，最后可檢測到合成細(xì)胞因子的陽性比例。流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法和ELISA方法互為補充，一般只有在兩種方法都得到陽性結(jié)果時，才能得出肯定的結(jié)論。

由于細(xì)胞因子通常是分泌蛋白質(zhì)，必須首先使用蛋白質(zhì)運輸抑制劑將其捕獲在細(xì)胞內(nèi)。兩種最常用的蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑為莫能菌素(Monensin, BD GolgiStop™抑制劑)和布雷菲德菌素A(Brefeldin A (BFA), BD GolgiPlug™抑制劑)。莫能菌素可與高爾基體跨膜Na++/H+轉(zhuǎn)運相互作用阻止蛋白質(zhì)的分泌，而布雷菲德菌素A將細(xì)胞內(nèi)分泌的蛋白質(zhì)從cis/高爾基體中間復(fù)合物重新分配到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。因此，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑的最佳選擇因細(xì)胞因子和物種而異(下表)。

流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法可以很容易地確定活化細(xì)胞群分泌的細(xì)胞因子是少數(shù)細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子的結(jié)果，還是大量細(xì)胞群每個細(xì)胞分泌少量細(xì)胞因子的結(jié)果。

流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法可便于同時測量多種細(xì)胞因子，以識別多功能細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色對多種研究都有用，包括B細(xì)胞和T細(xì)胞的分化和可塑性。

12、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)胞外染色法

Cytokine Secretion Assay-Detection kit是一種美天旎細(xì)胞因子分泌型細(xì)胞檢測試劑盒，專為高靈敏度地檢測分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞而研發(fā)的。獨特的技術(shù)優(yōu)勢使其可以檢測活細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況，并且對細(xì)胞的標(biāo)記兼容下游應(yīng)用，如細(xì)胞分選和培養(yǎng)。該試劑盒適用于刺激劑(例如多克隆刺激劑，CytoStim、抗原多肽、蛋白質(zhì)等)刺激后，抗原特異性CD4+T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞的檢測和研究。

多克隆刺激劑刺激T細(xì)胞3-16小時，T細(xì)胞活化；捕獲試劑與細(xì)胞共孵育，捕獲試劑的一端耦聯(lián)CD45抗體，所有白細(xì)胞都被捕獲試劑標(biāo)記，捕獲試劑另一端耦聯(lián)細(xì)胞因子特異性抗體；抗原特異性T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，分泌的細(xì)胞因子將被捕獲試劑所結(jié)合；加入細(xì)胞因子特異性的檢測試劑，耦聯(lián)熒光素的細(xì)胞因子抗體將與細(xì)胞因子，捕獲試劑形成帶熒光的三明治復(fù)合物，即可用流式進行檢測。

無需破膜固定，即可檢測活細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況，并且標(biāo)記的細(xì)胞適用于分選及分選后培養(yǎng)。

13、微球免疫分析技術(shù) CBA

微球免疫分析技術(shù)CBA (Cytometric Bead Array，CBA)即流式編碼微球芯片技術(shù)，又稱細(xì)胞因子微球檢測技術(shù)，是用流式細(xì)胞儀對多重蛋白進行定量檢測的方法，能夠同時對樣本中的多個指標(biāo)進行定性、定量檢測，可應(yīng)用于細(xì)胞因子檢測。

CBA是基于流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry)的原理，使用微米級熒光標(biāo)記的Bead，每種Bead上帶有特定抗體，這些抗體能夠與感興趣的細(xì)胞因子相結(jié)合。Bead被混合在待測樣本中，每種Bead具有不同的熒光信號，以便后續(xù)流式細(xì)胞儀的檢測和區(qū)分。

樣本中的目標(biāo)細(xì)胞因子或蛋白質(zhì)與Bead上的相應(yīng)抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。通過洗滌步驟去除未結(jié)合的成分，確保只有與抗體結(jié)合的Bead被保留。熒光標(biāo)記的二抗被引入系統(tǒng)后，與免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而標(biāo)記了被檢測的分子。Bead和樣本經(jīng)過混合和處理后，使用流式細(xì)胞儀來分析每個Bead的熒光信號。通過測量Bead的熒光強度，可以確定樣本中特定蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子的濃度。

CBA法的優(yōu)點是同時可以進行多參數(shù)檢測，快速并且信息量大，其優(yōu)勢體現(xiàn)在能夠同時對單個樣本進行多種檢測，所需樣本量少、靈敏度高、穩(wěn)定性好等。

14、電化學(xué)發(fā)光

電化學(xué)發(fā)光(Electrochemiluminescence, ECL)是基于ELISA基本原理的一種技術(shù)，使用96/384微孔板中(采用石墨材質(zhì)，背面帶有電路)作為底板，捕獲抗體形成夾心復(fù)合物。

待測樣本和三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的檢測抗體加入后，微孔板被置于電化學(xué)發(fā)光檢測儀器中，通電后發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使[Ru(bpy)₃]³⁺轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>[Ru(bpy)₃]²⁺，然后再還原為[Ru(bpy)₃]³⁺，形成循環(huán)反應(yīng)。在此過程中，釋放的光子(波長620nm)由檢測儀器中的CCD相機捕獲，其釋放量與待測物的濃度成正比。多個激發(fā)周期可以放大信號，提高了檢測靈敏度。

15、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

即將RNA的反轉(zhuǎn)錄(Reverse transcription)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。細(xì)胞因子的mRNA壽命短且拷貝數(shù)低，因此難以在小量樣本中進行檢測。RT-PCR是一種能檢測細(xì)胞內(nèi)低豐度特異RNA的方法，其原理是首先以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成與RNA互補的cDNA。然后以cDNA為模板，用PCR技術(shù)對靶序列進行擴展，使微量細(xì)胞因子的RNA經(jīng)放大后檢出。

該方法尤其適用于含量極少或容易降解的細(xì)胞因子，無視樣本類型，只需要設(shè)計好相對性的擴增引物及探針。但易出現(xiàn)假陽性和假陰性，在實驗中必須設(shè)嚴(yán)格的對照實驗。且測定結(jié)果只能代表細(xì)胞因子基因的表達，而不能代表活性細(xì)胞因子的水平，并且不容易對細(xì)胞因子表達水平進行定量。

16、質(zhì)譜法

即用電場和磁場將運動的離子(帶電荷的原子、分子或分子碎片)按它們的質(zhì)荷比分離后進行檢測的方法。

因為質(zhì)譜儀器的種類多，應(yīng)用范圍廣，其檢測靈敏度極高，但目前主要用于細(xì)胞因子檢測的方法有待進一步開發(fā)，市面上主要存在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)(PRM)方法和非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法。

PRM檢測法最多一次可檢測50種蛋白質(zhì)進行絕對/相對定量，非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法最多一次可檢測多達數(shù)千種蛋白質(zhì)進行絕對/相對定量，但重復(fù)性稍差，要嚴(yán)格控制操作條件。此外，生物樣品的前處理方法跟檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性息息相關(guān)。