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細(xì)胞壁的化學(xué)組成分析法

發(fā)布時間：2021/12/8 9:29:53 閱讀次數(shù)：1224

.全細(xì)胞分析法（薄層層析法）

（1）材料：①微晶纖維（Cellulose microcrystalline）；②層析缸：21cm x 6cm；③普通玻璃板：20cm X 5 cm；④標(biāo)準(zhǔn)氨基酸,糖.

（2）方法：

1）制板：把玻璃板洗凈,取微晶纖維每g加蒸餾水3.5ml（置三角瓶中）調(diào)成均勻糊狀；在玻璃板上涂成薄層,每個板約微晶纖維1.2-1.5 g,風(fēng)干,不需要活化,即可使用 .

2）用菌株生長的液體培養(yǎng)基,分裝于20 cm X 2 cm試管中,每管8ml.滅菌后接種并在搖床培養(yǎng)3～5天后,過濾培養(yǎng)液,用蒸餾水沖洗菌體兩次,再用無水乙醇沖洗兩次.取經(jīng)上述處理過的混菌體30mg裝于硬質(zhì)玻璃管內(nèi)（0.9 cm X 12 cm）,用于氨基酸分析,另取30mg用于糖組份分析.

3）菌體水解；在做氨基酸分析的玻璃管中放入6N HCl 0.1ml.在做糖分析的玻璃管中加入0.5N HCl 0.1ml,火焰封口,放入烘箱, 溫度上升120℃后,再持續(xù)15 min取出.用于氨基酸分析的水解液以黑褐色為宜,用于糖分析的水解液以黃棕色為宜.

4）點(diǎn)樣：用微量進(jìn)樣器抽取0.4μl氨基酸水解液點(diǎn)在薄板距下緣1 cm處,并點(diǎn)0.01 mol D,L-DAP,同時點(diǎn)含有L,L-DAP, meso-DAP和D-DAP的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液,以及天門冬氨酸,甘氨酸,谷氨酸,丙氨酸0.2 μl標(biāo)準(zhǔn)樣.取另一薄板,以相同方法點(diǎn)含有1％鼠李糖,核糖,木糖,阿拉伯糖,甘露糖,葡萄糖和半乳糖的混合液0.2μ1作為標(biāo)準(zhǔn)樣.

5）展層劑：氨基酸分析：甲醇：吡啶：冰乙酸：水（10:1:0.25:5）；糖分析：乙酸乙酷：吡啶：冰乙酸（8:5:1.5）.

6）展層：點(diǎn)好的薄板直接放入層析缸中,不需要飽和,層析時間約3h.

7）顯色：氨基酸分析：用0.4％莉三酮（水飽和正丁醇）；糖分析：用苯胺,鄰苯二甲酸.

以上分別噴顯色劑顯色：置100-110℃,2-5min,顯出顏色.核糖木糖和阿拉伯糖顯色后呈粉紅色,其他糖呈褐黃色.

2.純細(xì)胞分析（薄層層析法）

（1）材料：同全細(xì)胞分析法.

（2）方法：

1）制板：同全細(xì)胞分析法

2）菌體收集：取10 g對數(shù)后期濕菌體（不得用于菌體或開始自溶的菌體,也不要在室溫下保存的菌體,如需保存應(yīng)把菌體保存在冰凍狀態(tài)下）,懸浮于30-40ml,0.1 mol/L pH8.0磷酸緩沖液中,用超聲波破菌體,菌體破碎后,先用3000r/min離心3 min除去未破碎的菌體,上清液再以15000-16000 r/min離心,得到破碎的細(xì)胞壁.當(dāng)菌體的全細(xì)胞糖型為A（含半乳糖和阿拉伯糖）的菌較難破碎也較難沉淀,可適當(dāng)延長破碎和離心時間.這樣得到的細(xì)胞壁沉淀物用pH 8.0的磷酸緩沖液,95％的乙醇分別清洗二次,然后在2％的乙醇KOH溶液（2 g KOH溶于100 ml 95％乙醇中）中皂化（37℃振蕩2～3天）,再用95％乙醇,蒸餾水分別清洗二次,再用過濾過的含胰蛋白酶的pHS.O磷酸緩沖液（緩沖液中含胰蛋酶3 mg/ml）處理粗制細(xì)胞壁（37℃振蕩2h）,用pH S.O磷酸緩液,蒸餾水各清洗二次,清洗后的沉淀物再用胃蛋白酶的鹽酸溶液（3 mg/ ml 0.02N HCI）處理（37℃振蕩過夜）.然后再0.02N HCI 蒸餾水乙醇分別清洗2次,最后用氯仿清洗一次,得純細(xì)胞壁.

3）菌體水解：同全細(xì)胞分析法

4）點(diǎn)樣：同全細(xì)胞分析法

5）展層法：氨基酸分析：甲醇：吡啶：冰乙酸：水（10:0.5:0.125:2.5）；糖分析：同細(xì)胞壁分析法.

6）顯色劑及顯色：同全細(xì)胞分析.

本文節(jié)選自《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》第十四章