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人胃癌細胞KATO III培養(yǎng)說明-2022已更新

發(fā)布時間：2022/8/16 7:11:37 閱讀次數(shù)：972

一細胞培養(yǎng)條件

細胞名稱	人胃癌細胞KATO III
生長特性	球形；部分貼壁部分懸浮生長	凍存條件	無血清凍存液
培養(yǎng)體系	IMDM+20%FBS
傳代方法	第一次建議1:2傳代	傳代情況	2天換液
備注	用無菌離心管收集瓶子培養(yǎng)基,留作過渡培養(yǎng)

二細胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運輸細胞的最好辦法.收到細胞用75%酒精噴灑整個細胞瓶,消毒后放到超凈臺內嚴格無菌操作,將細胞瓶放入37℃ 5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細胞狀態(tài)后再做處理.顯微鏡觀察細胞生長情況,并對細胞進行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張）,前三天照片是重要售后依據(jù),不提供照片默認收到狀態(tài)良好.（注意密封培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時要將蓋子擰松,傳代后建議一瓶用原瓶的完全培養(yǎng)基,另外一瓶用自己配的完全培養(yǎng)基,以便進行對比培養(yǎng)）

三細胞培養(yǎng)步驟

a 細胞傳代：如果未超過80%匯合度時,將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中,留5ml完全培養(yǎng)基,放入37℃ 5%CO₂孵箱培養(yǎng)；如果細胞密度超80%,即可進行傳代培養(yǎng).

1 貼壁細胞傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次.

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上完全培養(yǎng)基終止消化.

3.輕輕吹打細胞,使之完全脫落后吸出,然后將懸液轉移至15ml離心管中,在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸.

4. 將細胞懸液按1：2的比例進行分瓶傳代（兩個T25瓶）,補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入到37℃ 5%CO₂的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

2 懸浮細胞傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞,1000RPM條件下離心8-10分鐘,棄上清液,補加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻,將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或瓶中.

方法二：可選擇半數(shù)換液方式,棄半數(shù)培養(yǎng)基后,將剩余細胞懸起,將細胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基新皿中或者瓶中.

b 細胞凍存：

1 細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時,棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細胞一次；

2 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細胞使之脫落,然后將懸液轉移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min；

（懸浮細胞直接將培養(yǎng)瓶中的懸液收集至離心管中1000rpm 離心5min；）

3 棄上清,沉淀細胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號：C7001）,混勻后加入凍存管中.

4 將凍存細胞直接放入-80℃冰箱即可,如后期要將細胞轉入液氮罐中,則需在-80℃冰箱中存放24小時以上再轉入液氮罐中.

C 細胞復蘇：

1 從液氮中取出細胞凍存管（注意佩戴防護面具）,快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2 將凍存管中的細胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中,1000rpm離心5min；

3 棄上清,沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸,接種至T25培養(yǎng)瓶,放于37℃,5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4 第二天,換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).

四 注意事項：有些細胞比較特殊,如貼壁不牢,在運輸過程中發(fā)生容易細胞脫落,這是正常現(xiàn)象.請將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,1000rpm離心5min,收集上清作過渡培養(yǎng)（后期對比培養(yǎng)）,沉淀加入胰酶1-2ml,輕輕吹打,重懸,消化1-2分鐘后,加5ml完全培養(yǎng)基終止反應.再離心,棄上清,加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸.然后按1:2比例進行分瓶傳代（兩個T25）,補充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入37℃,5%CO₂細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).