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人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3培養(yǎng)說明書

發(fā)布時(shí)間：2022/11/16 9:19:04 閱讀次數(shù)：433

人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3培養(yǎng)說明書

一細(xì)胞培養(yǎng)條件

產(chǎn)品名稱	人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3
生長(zhǎng)特性	貼壁生長(zhǎng)	凍存條件	無血清凍存液（貨號(hào)：C7001）
培養(yǎng)體系	ECM培養(yǎng)基（瓶中為維持培養(yǎng)基,請(qǐng)及時(shí)更換培養(yǎng)基方可進(jìn)行后續(xù)操作）
傳代方法	第一次建議1:2傳代	傳代情況	2天換液
備注	1 收到后及時(shí)更換培養(yǎng)基.傳代時(shí)用含10% FBS的培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS或1640+10%FBS均可）終止消化并離心收集. 2 傳代需使用新的培養(yǎng)器皿（6cm皿或T25瓶）

二細(xì)胞收到后處理

培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運(yùn)輸細(xì)胞的最好辦法.收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個(gè)細(xì)胞瓶,消毒后放到超凈臺(tái)內(nèi)嚴(yán)格無菌操作,將細(xì)胞瓶放入37℃ 5%CO₂的培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理.顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張）,前三天照片是重要售后依據(jù),不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好.（注意密封培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱時(shí)要將蓋子擰松,傳代后建議一瓶用原瓶的完全培養(yǎng)基,另外一瓶用自己配的完全培養(yǎng)基,以便進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)）

三細(xì)胞培養(yǎng)步驟 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3培養(yǎng)說明書

a 細(xì)胞傳代：如果未超過80%匯合度時(shí),將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中,留5ml完全培養(yǎng)基,放入37℃ 5%CO₂孵箱培養(yǎng)；如果細(xì)胞密度超80%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng),傳代具體步驟如下：

1. 棄去培養(yǎng)上清,用不含鈣鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次.

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1-2ml至培養(yǎng)瓶中,置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺(tái),輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的培養(yǎng)基終止消化.

3.輕輕吹打細(xì)胞,使之完全脫落后吸出,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,在1000RPM條件下離心5分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加1-2mL完全培養(yǎng)基重懸.

4. 將細(xì)胞懸液按1：2的比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25瓶）,補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入到37℃ 5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

b 細(xì)胞凍存：

1 細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),棄T25培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞一次；

2 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞回縮變圓后加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心 5min；

3 棄上清,沉淀細(xì)胞加入1ml的雅吉生物無血清凍存液（貨號(hào)：C7001）,混勻后加入凍存管中.

4 將凍存細(xì)胞直接放入-80℃冰箱即可,如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中,則需在-80℃冰箱中存放24小時(shí)以上再轉(zhuǎn)入液氮罐中.

C 細(xì)胞復(fù)蘇：

1 從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意佩戴防護(hù)面具）,快速將其置入 37℃水浴中解凍, 直至凍存管中無結(jié)晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2 將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的15ml離心管中,1000rpm離心5min；

3 棄上清,沉淀用5ml完全培養(yǎng)基重懸,接種至T25培養(yǎng)瓶,放于37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4 第二天,換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).

四 注意事項(xiàng)：有些細(xì)胞貼壁不牢,在運(yùn)輸過程中細(xì)胞容易脫落,這是正常現(xiàn)象.如脫離較多可將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管,1000rpm離心5min,收集上清作過渡培養(yǎng)（后期對(duì)比培養(yǎng)）,沉淀加入胰酶1-2ml,輕輕吹打,重懸,消化1-2分鐘后,加5ml完全培養(yǎng)基終止反應(yīng).再離心,棄上清,加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸.然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代（兩個(gè)T25）,補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至5-8ml/瓶,最后放入37℃,5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3培養(yǎng)說明書