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發布時間:2022/11/29 8:47:50 閱讀次數:465
細胞描述:
小鼠胚胎干細胞.該細胞缺乏 HGPRT(HPRT),并且對 0.06 mM 的 6-硫鳥嘌呤有抗性.當在飼養層(胚胎成纖維細胞或 STO 細胞)上培養時,細胞保持未分化狀態.在沒有飼養層的情況下,細胞自發分化并形成胚胎結構.當注入胚泡中時,細胞可以進入生殖系.在常規的分子基因修飾技術之后,它們可用于重構小鼠胚胎.培養時需使用昆明白MEF作為飼養層細胞.
細胞特性
1) 來源:小鼠,129/Ola品系,胚胎內細胞團
2) 形態:球形克隆 貼壁生長
3) 含量:>1x106 細胞數
4) 規格:1mL凍存管包裝
5) 用途:僅供科研使用
運輸和保存:干冰運輸:1mL凍存管包裝干冰運輸,收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇,若發現干冰已揮發干凈 凍存管瓶蓋脫落 破損及細胞有污染,請立即與我們聯系.
一.培養基及培養凍存條件準備:
1)準備DMEM 基礎培養基 (0001) 81%
優質胎牛血清 (0500) 15 %
GlutaMAX-1谷氨酰胺 ( 0900 ) 1 %
MEM NEAA非必需氨基酸 (01000) 1%
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉 ( 01100 ) 1%
P/S青霉素-鏈霉素 (15140-122) 1%
β-巰基乙醇 (8211) 0.5 mL(1000X)
LIF (50756) 5μg(10ng/mL)
使用昆明白MEF作為飼養層細胞.
2)培養條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%. 溫度:37℃,培養箱濕度為70%-80%.
3)凍存液:完全培養液 60%%,FBS 30%%,DMSO 10%%現用現配.
我庫凍存時,體積為 500 μl,預期存活率 70%,每支凍存管的細胞復蘇,3 至4 天后,會形成 30 至 40 個克隆,建議復蘇至 1 個 T25 培養瓶中.
二:細胞處理:
1. 在 T25 培養瓶中加入 0.2%明膠,搖勻后覆蓋底面即可,于 37℃細胞培養箱至少放置 15 min 以上.
2. 吸除 0.2%明膠,加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF 完全培養液.一般地,一個 T25 培養瓶中加入 5 ml MEF 完全培養液.
3. 按實驗需要:小鼠胚胎干細胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF;復蘇 MEF 細胞若干支.將凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染.
4. 將凍存管內細胞懸液轉移至含 2 ml MEF 完全培養液的 15 ml 離心管內,以1000 rpm,離心 5 min,離心后將上清液吸除,另加入新鮮的 MEF 完全培養液 1 ml,重懸后按照一個 T25 培養瓶鋪 1´106 的 MEF 細胞,平均加入到 T25 培養瓶中,輕輕搖勻后置于 37℃細胞培養箱.24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細胞.
5.復蘇或傳代小鼠胚胎干細胞前,將 T25 培養瓶中的 MEF 完全培養液吸除,加入 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液輕輕沖洗一遍后吸除,加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養液待用.
1.將小鼠胚胎干細胞凍存管從液氮中取出,置于 37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染.
2. 將凍存管內細胞懸液轉移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液的 15ml 離心管內,以 1000 rpm,離心 5 min.
3. 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養液 2 ml,吹打懸浮.
4. 重復吹打,制成單細胞懸液,盡量避免氣泡.
5. 轉移至 1 個已經鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中培養.
6. 每天更換小鼠胚胎干細胞完全培養液.
傳代:
1. 一般在復蘇后第 2-3 天傳代,視克隆大小和密度而定
2. 吸除廢液.
3. 用 PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍.
4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶(含 EDTA)至培養瓶,輕輕晃動,使胰酶覆蓋底面,置于 37℃培養箱內消化細胞.
5. 在顯微鏡下觀察,直至細胞層全部脫落(一般需要 1-2 min).
6. 加 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液終止消化.
7. 以 1000 rpm,離心 5 min,棄上清.
8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液,多次輕輕吹打細胞, 制成單細胞懸液.
9. 加入足量的小鼠胚胎干細胞完全培養液,吹打混勻,細胞懸液分裝到鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中.一般地,一個 T25 培養瓶加入 5-6 ml 培養液.放入 37℃培養箱內培養.每天換液.
傳代比例:1:4-1:7
1.按傳代的方法將細胞消化下來,制成細胞懸液.
2. 以 1000 rpm,離心 5 min,棄上清,逐滴加入已經預冷的凍存液,懸浮細胞.
3. 按每支存管內加入 500 ml 細胞懸液分裝到凍存管內,標記細胞名稱 代數 凍存日期等基本信息.
4.將凍存管置于程序降溫盒內,-80℃過夜,轉入液氮.
凍存液配方:
小鼠胚胎干細胞完全培養液 60%,ES 級 FBS 30%,DMSO 10%
1.培養中的小鼠胚胎干細胞,按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后,加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞完全培養液重懸細胞, 吹打混勻,細胞懸液分裝到無 MEF 細胞的培養皿或培養瓶(一般地,一個T25 培養瓶中培養的小鼠胚胎干細胞,在一個 10 cm 培養皿中進行差速貼壁.不要事先鋪明膠,如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞)中.
2. 培養皿或培養瓶置于 37°C 培養箱內靜置 1 小時.
3. 1 小時后,絕大部分 MEF 細胞已貼在培養皿或培養瓶底面,而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養液中.收取培養液,進行后續實驗.
注意事項:
1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級生物安全臺內操作,并請注意防護,所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄.
2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套 衣服和戴上防護面罩.注意:凍存管浸沒在液氮中會泄漏,并會慢慢充滿液氮.解凍時,液氮轉化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子,從而產生飛揚的碎屑造成人員傷害.
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