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小鼠胚胎干細胞E14培養說明書

發布時間:2022/11/29 8:47:50      閱讀次數:465

 小鼠胚胎干細胞E14培養說明書ES-E14TG2a

 

 細胞描述:

小鼠胚胎干細胞.該細胞缺乏 HGPRT(HPRT),并且對 0.06 mM 的 6-硫鳥嘌呤有抗性.當在飼養層(胚胎成纖維細胞或 STO 細胞)上培養時,細胞保持未分化狀態.在沒有飼養層的情況下,細胞自發分化并形成胚胎結構.當注入胚泡中時,細胞可以進入生殖系.在常規的分子基因修飾技術之后,它們可用于重構小鼠胚胎.培養時需使用昆明白MEF作為飼養層細胞.

 

細胞特性

1) 來源:小鼠,129/Ola品系,胚胎內細胞團

2) 形態球形克隆 貼壁生長

3) 含量:>1x106  細胞數

4) 規格:1mL凍存管包裝

5) 用途:僅供科研使用

運輸和保存:干冰運輸1mL凍存管包裝干冰運輸,收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇,若發現干冰已揮發干凈 凍存管瓶蓋脫落 破損及細胞有污染,請立即與我們聯系.

 

一.培養基培養凍存條件準備:

1)準備DMEM 基礎培養基 (0001)         81%      

優質胎牛血清 0500             15 %

GlutaMAX-1谷氨酰胺  ( 0900 )         1 %

MEM NEAA非必需氨基酸 (01000)      1%

Sodium Pyruvate丙酮酸鈉 ( 01100 )      1%

P/S青霉素-鏈霉素 (15140-122       1%

β-巰基乙醇  (8211)                    0.5 mL1000X)

LIF  (50756)                         5μg10ng/mL

使用昆明白MEF作為飼養層細胞.

2)培養條件 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%. 溫度:37℃,培養箱濕度為70%-80%.

3凍存液:完全培養液 60%%,FBS 30%%,DMSO 10%%現用現配.

我庫凍存時,體積為 500 μl,預期存活率 70%,每支凍存管的細胞復蘇,3 4 天后,會形成 30 40 個克隆,建議復蘇至 1 T25 培養瓶中.

二:細胞處理:

MEF 細胞鋪制:

1.  T25 培養瓶中加入 0.2%明膠,搖勻后覆蓋底面即可,于 37細胞培養箱至少放置 15 min 以上.

2. 吸除 0.2%明膠,加入事先水浴加熱至 37℃MEF 完全培養液.一般地,一個 T25 培養瓶中加入 5 ml MEF 完全培養液.

3.  按實驗需要:小鼠胚胎干細胞使用 KM-r P3 MEF  CF-1 P3 MEF復蘇 MEF 細胞若干支.將凍存管從液氮中取出,置于37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染.

4. 將凍存管內細胞懸液轉移至含 2 ml MEF 完全培養液的 15 ml 離心管內,以1000 rpm,離心 5 min,離心后將上清液吸除,另加入新鮮的 MEF 完全培養液 1 ml,重懸后按照一個 T25 培養瓶鋪 1´106 MEF 細胞,平均加入到 T25 培養瓶中,輕輕搖勻后置于 37℃細胞培養箱.24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細胞.

5.復蘇或傳代小鼠胚胎干細胞前,將 T25 培養瓶中的 MEF 完全培養液吸除,加入 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液輕輕沖洗一遍后吸除,加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養液待用.

復蘇:

1.將小鼠胚胎干細胞凍存管從液氮中取出,置于 37℃水浴中使之迅速融解,取出后拿到超凈臺內用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁,防止污染.

2. 將凍存管內細胞懸液轉移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液的 15ml 離心管內,以 1000 rpm,離心 5 min.

3. 離心后將上清液吸除,另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養液 2 ml,吹打懸浮.

4. 重復吹打,制成單細胞懸液,盡量避免氣泡.

5.  轉移至 1 個已經鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中培養.

6. 每天更換小鼠胚胎干細胞完全培養液.

傳代

1. 一般在復蘇后第 2-3 天傳代,視克隆大小和密度而定

2. 吸除廢液.

3. PBS(不含鈣鎂離子)輕輕沖洗一遍.

4. 加入 1.0 ml 0.25%胰酶(含 EDTA)至培養瓶,輕輕晃動,使胰酶覆蓋底面,置于 37℃培養箱內消化細胞.

5. 在顯微鏡下觀察,直至細胞層全部脫落(一般需要 1-2 min).

6.   2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液終止消化.

7.   1000 rpm,離心 5 min,棄上清.

8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液,多次輕輕吹打細胞, 制成單細胞懸液.

9. 加入足量的小鼠胚胎干細胞完全培養液,吹打混勻,細胞懸液分裝到鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中.一般地,一個 T25 培養瓶加入 5-6 ml 培養液.放入 37℃培養箱內培養.每天換液.

傳代比例:1:4-1:7

凍存:

1.按傳代的方法將細胞消化下來,制成細胞懸液.

2.   1000 rpm,離心 5 min,棄上清,逐滴加入已經預冷的凍存液,懸浮細胞.

3. 按每支存管內加入 500 ml 細胞懸液分裝到凍存管內,標記細胞名稱 代數 凍存日期等基本信息.

4.將凍存管置于程序降溫盒內,-80℃過夜,轉入液氮.

存液配方:

小鼠胚胎干細胞完全培養液 60%,ES FBS 30%,DMSO 10%

  小鼠胚胎干細胞E14培養說明書

附:小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞分離的簡易方法(差速貼壁法

1.培養中的小鼠胚胎干細胞,按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后,加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞完全培養液重懸細胞, 吹打混勻,細胞懸液分裝到無 MEF 細胞的培養皿或培養瓶(一般地,一個T25 培養瓶中培養的小鼠胚胎干細胞,在一個 10 cm 培養皿中進行差速貼壁.不要事先鋪明膠,如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞)中.

2. 培養皿或培養瓶置于 37°C 培養箱內靜置 1 小時.

3.  1 小時后,絕大部分 MEF 細胞已貼在培養皿或培養瓶底面,而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養液中.收取培養液,進行后續實驗.

 

注意事項:

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性,必須在二級生物安全臺內操作,并請注意防護,所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄.

2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套 衣服和戴上防護面罩.注意:凍存管浸沒在液氮中會泄漏,并會慢慢充滿液氮.解凍時,液氮轉化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子,從而產生飛揚的碎屑造成人員傷害. 小鼠胚胎干細胞E14培養說明書


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