腸道免疫簡介
腸道是我們熟知的重要消化器官,主要執行消化 吸收 排毒功能,事實上腸道也是機體最大的免疫器官,還具有免疫防衛和神經調節功能.那么腸道是如何執行免疫功能的呢？首先,我們要知道腸道的免疫功能是由黏膜免疫系統執行的.黏膜免疫系統與外部世界密切接觸,包括微生物群 病原體和環境抗原,這需要對免疫反應進行微調,使對病原體的有效反應,同時保持對無害刺激的耐受性.粘膜免疫系統有機體70%以上的免疫細胞,如巨噬細胞 T細胞 NK細胞 B細胞等,集中在腸道,有70%以上的免疫球蛋白A,由腸道制造,用來保護腸道.
圖1 小鼠腸黏膜免疫系統構成
粘膜腸上皮細胞由單層腸道上皮細胞組成,它們對營養吸收至關重要,并為有害物質提供屏障.在粘膜單層柱狀上皮細胞之間 粘膜上皮細胞的基底膜上,存在著上皮淋巴細胞（Intestinal intraepithelial lymphocyte, IEL）.平均每100個腸上皮細胞之間就有10-20個IEL,80%以上的IEL為CD8+T淋巴細胞；IEL能以非MHC限制的方式直接識別未加工的抗原并發揮溶細胞活性,是機體早期抗感染的重要方式.
IEL可以根據TCR受體的表達譜分為以下幾類：TCRab TCRgd TCR-,具體分類見下圖：
（1）脫頸處死小鼠,噴適量酒精于腹部,開腹暴露腸道.（2）滴適量 Buffer 1（5% RPMI1640 + 5% FBS + 10 mM HEPES）潤濕腹腔,將腸道整體向上推翻,找到直腸.由直腸至胃,自下而上分離腸管和系膜等結締組織.剪取胃下至回盲部上端的小腸,兩次對折浸入 5 mL Buffer1中.（3）小腸放入培養皿內并等分.在 Buffer 1 潤濕的擦拭布上除去脂肪和淋巴結并剖開.在含有Buffer 1的培養皿中依次清洗小腸,清洗干凈后將小腸剪成 1 cm 片段浸入25 mL Buffer 1中.（4） 取材全部結束后,每管加入 1 mM DTT,搖床 37℃,200 rmp,消化 20 min.（5）消化結束后再次離心,4℃,600 rmp,瞬離 30 s.其目的是使未消化徹底的組織沉淀在底部,保證過濾順暢.離心結束后用 100 μm 濾網并收集上清.（6）剩余組織每管加入 25 mL Buffer 2（ RPMI1640+25 mM EDTA+ 20 mM HEPES）繼續消化.搖床 37℃,200 rmp,30 min.（7）第二次消化結束后先用渦旋儀劇烈地漩渦兩次,再次離心,4℃ 600 rmp,30 s.（8）收集兩次消化獲得的上清混勻并進行 4℃離心,2000 rmp,4 min.（9）每管加入10 mL 44%的分離液,離心,2000 rmp,20 min升6降0.（10）收集底部沉淀并加入 25 mL Buffer 1 洗一遍,4℃,1500 rmp,5 min,棄上清.此時獲得的細胞即為我們所需的腸上皮淋巴細胞.
圖3 小鼠回腸解剖方法展示
小鼠腸上皮淋巴細胞純度及亞群鑒定
圖 4 小鼠腸上皮淋巴細胞分離后細胞純度及活性鑒定
上文我們已經展示了小鼠腸上皮淋巴細胞IEL的分類,下面我們用流式細胞術詳細展示各亞群的圈門策略.小鼠小腸中提到的IEL亞群一般為TCRγδ+ CD4-CD8αα+ （TCRγδCD8αα）, TCRαβ+CD4-CD8αα+ （TCRαβ CD8αα）, TCRαβ+ CD4-CD8αβ+（TCRαβ CD8αβ）, TCRαβ+ CD4+CD8α-（TCRαβ CD4） 和 TCRαβ+ CD4+CD8αα+ （TCRαβ DP）. TCRαβ CD8αβ 和TCRαβ CD4 IEL通常被認為是組駐留記憶T細胞,在抗原暴露后會遷移到上皮細胞,相反,前兩種亞型通常被認為是非傳統的或者先天T細胞,它們直接從胸腺遷移到腸上皮或者經歷選擇性原位擴張后,組成性地填充腸上皮.
圖 5 小鼠腸上皮淋巴各亞群細胞圈門策略
小鼠腸上皮淋巴細胞的體外培養
IEL單獨體外培養很容易死亡,IL-15可以短期內維持其活性,而IL-15/IL-15R復合體更加有效.如果需要長期培養,則需要在有多種細胞因子的情況下進行TCR刺激.
短期培養：
細胞鋪板,106細胞重懸于96孔板中,并加入20 ng/mL的小鼠IL-15/IL-15R復合物重組蛋白使其終體系為200μL.37 ℃二氧化碳培養箱中可維持1-3天.
長期培養：（1）取anti-mouse CD3ε, clone 145-2C11置于96孔圓底板上（1μg/mL,每孔50μL）, 37℃ 孵育2小時或4℃ 過夜包被.然后用無菌PBS洗滌3次.（2）將IEL以5×105/ml重新懸浮96孔板中,并加入以下細胞因子：IL-2（10 IU/mL） IL-3（100 IU/mL） IL-4（100 IU/mL）,IL-3（100 IU/mL）,IL-4（100 IU/mL）,和可溶性的IL-15（100 ng/mL）.（3）200μL體系,37 ℃二氧化碳培養箱中培養48h.（4）洗滌細胞兩次,1×105每孔重懸于含IL-2（10 IU/mL）的培養基中.（5）每隔3-4天更換新鮮的含IL-2的培養基.
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