免疫熒光染色分為直接法和間接法.直接法是熒光素直接標記在一抗上,孵育后直接觀測,快速高效,還可以與多個標記抗體一起做多重熒光染色.間接法是熒光素標記在二抗上,相比直接法染色背景更干凈,費用花費也少.
免疫熒光染色與免疫組化前期處理相同,因為內源性過氧化物酶對免疫熒光實驗沒有影響,同時雙氧水反而會干擾到熒光素發光,所以這步操作在免疫熒光中不需要做.
常用的熒光顯微鏡一般有三個通路,激發波長為350nm 488nm 555nm附近,分別對應的熒光發射光顏色為藍光 綠光 紅光.
350nm常用熒光素：DAPI（復染用）,Alexa Fluor 350
488nm常用熒光素：FITC,Alexa Fluor 488
555nm常用熒光素：PE Cy3 Rhodamine B Alexa Fluor555
另有其他常見熒光素
594nm常用熒光素：Texas Red Alexa Fluor594
647nm常用熒光素：Cy5 APC Alexa Fluor647
免疫熒光雙重染色熒光雙染或多重染色是指將帶有不同熒光素標記的抗體孵育在同一張切片上,鏡下觀察時將不同的顏色組合在一起,將不同的抗原表達情況一起呈現出來,這樣分析多個抗原的關聯性更客觀 更直接.
熒光雙染也有直接法和間接法.直接法是使用帶有不同熒光素標記的兩個抗體同時孵育后觀測；間接法需要用到兩個不同種屬來源的一抗（例如一個鼠源抗體,一個兔源抗體）,后面要選擇與一抗相對應的二抗同時需要帶有不同的熒光素標記（例如FITC標記山羊抗小鼠和Cy3標記山羊抗兔）,間接法需要同時兼顧一抗和二抗的種屬關系,避免出現相互的交叉反應.
石蠟切片的免疫熒光單染（間接法）
1.石蠟切片正常脫蠟至水,PBS洗5分鐘,2次
2.抗原修復,0.01M枸櫞酸修復液,沸水浴熱修復15分鐘
3.正常山羊血清封閉20分鐘,37℃
4.一抗孵育,4℃過夜.
5.PBS洗5分鐘,3次
6.熒光標記二抗孵育,37℃,90分鐘
7.PBS洗5分鐘,3次
8.DAPI復染,PBS洗5分鐘,3次
9.防淬滅熒光封片劑封片
10.鏡檢
