【預(yù)期用途】
本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測狂犬病病毒，對狂犬病病毒引起的疾病診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對狂犬病病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含狂犬病病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
| 序號 | 組成 | 25 T/盒 | 50 T/盒 |
| 1 | PCR反應(yīng)液 | 437.5 μL×1管 | 875 μL×1管 |
| 2 | 混合酶液 | 62.5 μL×1管 | 125 μL×1管 |
| 3 | 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
| 4 | 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
| 5 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為犬基因組DNA，陽性對照為經(jīng)滅活處理的狂犬病病毒核酸提取物。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.70日齡以內(nèi)流產(chǎn)胎兒、死胎、木乃伊胎及弱仔的腦、腎、睪丸、腸系膜淋巴結(jié)或母犬的胎盤、陰道分泌物和精液均可作為檢測病毒的材料。以腸系膜淋巴結(jié)和肝臟檢出率最高。
2.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中，3000 rpm 離心10分鐘取上清待檢。
4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
5.標(biāo)本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
| 單反液配制表(每份) | PCR反應(yīng)液 | 17.5 μL |
| 混合酶液 | 2.5 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司病毒提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。
| 反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集狂犬病病毒熒光信號 |
| PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
| UNG酶 | 50℃：2分鐘（min） | 1 | |
| 預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
| 預(yù)擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
| 55℃：40秒（s） | |||
| PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
| 55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤33。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤33或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在33～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進行重復(fù)檢測，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在33～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
| 通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 |
| FAM | |
| 陽性（＋） | 標(biāo)本中檢出狂犬病病毒DNA |
| 標(biāo)本中未檢出狂犬病病毒DNA |
【檢驗方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為102 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項】
1. 整個檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作，各區(qū)實驗服、儀器、耗材應(yīng)獨立使用，不能混用；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進行操作；三個區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。
2. 為避免DNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理。
3. 每次實驗應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心。
5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨存放。
6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標(biāo)記。
7. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置；不同批號試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9. 實驗過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進行無害化處理后方可丟棄。
