產(chǎn)品及特點(diǎn)規(guī)格及成分
即用型PCR 試劑盒 3.0是在本公司即用型PCR 試劑盒2.0 的基礎(chǔ)上改良而來，內(nèi)含Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR 增強(qiáng)劑、上樣染料（對A 型）等所有PCR 所需要的成分,具有廣泛的用途。本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：,
1. 方便，用戶只需準(zhǔn)備模板和引物即可以進(jìn)行PCR 實(shí)驗(yàn)。
2. 產(chǎn)品為2×預(yù)配液，操作步驟已經(jīng)最大限度地簡化，能減少污染，降低實(shí)驗(yàn)誤差。
3. 擴(kuò)增效率和靈敏度更高。
4. 本產(chǎn)品 A 型含電泳染料,PCR 反應(yīng)液可直接上樣電泳，進(jìn)一步簡化了操作。
5. 產(chǎn)物可直接用于T 載體克隆，不需要額外的加A 反應(yīng)。
6. 本產(chǎn)品足夠50 次40 mL 體系的常規(guī)PCR。
7. 本產(chǎn)品只供科研使用。
本產(chǎn)品A 型（90805A）中直接加入了專用染料，PCR 后可以直接上樣電泳。
本產(chǎn)品B 型（90805B）中沒有加入專用染料，客戶需要加上樣液后才可上樣電泳。
即用型PCR 試劑盒低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 有效期一年。
DNA 模板、引物、超純水。
以30 mL 的標(biāo)準(zhǔn)PCR 反應(yīng)體系為例：在一干凈的PCR 管中，加入下列成分：
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| 補(bǔ)水到 | 30 mL |
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| 放入PCR 儀中進(jìn)行PCR, 結(jié)束后取 5-10 mL 直接上樣電泳（對A 型產(chǎn)品，如果是 B型產(chǎn)品，則需要額外再加 DNA 上樣液后才能電泳）, 紅色染料電泳速度相當(dāng)于 50 bp DNA 片段。
注意： 1. 如果反應(yīng)體系不是 30 mL，各成分需要等按比例增加或減少。 2. 如果 DNA 模板中有 PCR 不明抑制物（植物、土壤和血液等 DNA 樣品常含此類抑制物），可以在 PCR 體系中加入 1/10 的 PCR 抑制物清除劑（CAT#：60804， 30mL 體系中加 3mL），可能會對 PCR 有幫助。 | ||||
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即用型PCR 試劑盒相關(guān)資料 |
PCR 反應(yīng)的影響因素 變性溫度與時(shí)間：模板變性溫度是決定PCR 反應(yīng)中雙鏈 DNA 解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈 DNA 模板，PCR 也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全， DNA 雙鏈會很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。變性溫度太高，又會影響酶的活性。一般情況下可設(shè)為 94℃ 20~30 秒，高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持耐熱 DNA 聚合酶的活力， 最高變性溫度不宜超過 95℃。 退火溫度與時(shí)間：退火溫度決定 PCR 特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA 擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板 錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在 45~68℃之間。設(shè)置特定反應(yīng)的最適退火溫度，可根據(jù)引物的（G+C）%含量進(jìn)行推測，一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引 物的熔解溫度 Tm 低 5℃，退火時(shí)間一般為 30~60 秒，足以使引物與模板之間完全結(jié)合，長時(shí)間退火沒有必要。 延伸溫度與時(shí)間：PCR 反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 70~75℃之間，延伸時(shí)間根據(jù)所用 聚合酶擴(kuò)增速度和擴(kuò)增片段大小設(shè)定，如同樣擴(kuò)增 2 Kb 片段，若使用 Taq 酶只需 1 分鐘，使用 Pfu 酶則應(yīng)設(shè)定 2 分鐘以上。延伸時(shí)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)，時(shí)間太短則可能得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。 循環(huán)次數(shù)：可根據(jù)模板 DNA 的量、擴(kuò)增片段的大小和擴(kuò)增產(chǎn)物的下步應(yīng)用等因素，設(shè) 定 20-40 個(gè)循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足，如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配幾率會增加， 非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。 酶量：50 μL 反應(yīng)體系可用 0.5-5 U 酶，酶量的選擇與模板DNA 的量，擴(kuò)增片段大 小等有關(guān)，酶量過多易發(fā)生非特異性反應(yīng)，而且可能增加突變的機(jī)率，尤其在進(jìn)行高 保真擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)盡量減少酶量，但酶量過少時(shí)反應(yīng)性能下降。 | |||
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| 模板：模板可以是單鏈 DNA，也可以是雙鏈 DNA，質(zhì)粒 DNA 的擴(kuò)增效率略低于線狀 DNA。模板加量一般不需太多，不超過 1 μg 為宜，因?yàn)榧恿窟^多可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加，但是要考慮模板中靶序列的含量。例如，使用基因組為模板擴(kuò)增單拷貝或低拷貝靶序列，就需要適當(dāng)加大模板用量。 引物：引物與模板配對的長度應(yīng)至少為17個(gè)核苷酸，最高不宜超過30個(gè)核苷酸，最佳 長度為20~24個(gè)核苷酸，如需插入酶切位點(diǎn)，應(yīng)在酶切位點(diǎn)5’端多加幾個(gè)堿基，有利 于酶切。引物的（G+C）%含量組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個(gè) 引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似。引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的次級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié) 構(gòu)。兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3’端。如果可能，引物3’端最好富有GC，這樣退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物最好經(jīng)過色譜層析純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-2 μM 左右，濃度太高會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，太低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少。 |
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關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | PCR Inhibitor Erasol (CAT#:60804)。即用型PCR 試劑盒 |
