口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒檢測試劑盒（雙色實(shí)時熒光 PCR 法）說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒檢測試劑盒（雙色實(shí)時熒光 PCR 法）
英文名稱：Foot and Mouth Disease Virus、Seneca virus A Detection Kit (Dual ChanelReal-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒檢測，可用于臨床口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒感染的輔助診斷，但不作確診使用。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒基因組模板的情況下，PCR 反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量 PCR 儀對PCR 過程中相應(yīng)通道信號進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。
【主要組成成份】
| 序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
| 1 | SVA/FMDV RT-PCR 反應(yīng)液 | 437.5 μL×1 管 | 875 μL×1 管 |
| 2 | SVA/FMDV 混合酶 | 62.5 μL×1 管 | 125 μL×1 管 |
| 3 | SVA/FMDV 陽性對照 | 40 μL×1 管 | 40 μL×1 管 |
| 4 | SVA/FMDV 陰性對照 | 40 μL×1 管 | 40 μL×1 管 |
| 5 | 說明書 | 1 份 | 1 份 |
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注：陰性對照為豬基因組 DNA，陽性對照為失去活性的口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒cDNA。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融，有效期 12 個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad 系列、Agilent Stratagene MX 系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene 系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時熒光定量PCR 儀。
【樣本要求】
1. 血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
2. 肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3 克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中，3000rpm/min離心 10 分鐘取上清待檢。
3. 應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
4. 標(biāo)本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于 2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1） 從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2） 核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
| 單反液配制表(每份) | RT-PCR 反應(yīng)液 | 17.5 μL |
| 混合酶 | 2.5 μL |
（3） 在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照 20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR 反應(yīng)管。
2. 樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用 QIAGEN、Roche 公司 RNA 提取試劑盒提取 RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3. 加樣
在上述制備好的 PCR 反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本 RNA 各 5 μl、終體積 25 μl/管，蓋好 PCR 反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR 儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加 5 μL 試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為 25 μl/管，蓋好 PCR 反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到 PCR 儀器上。
4. PCR（PCR 擴(kuò)增區(qū)）
（1） 取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的 PCR 反應(yīng)管，放置在實(shí)時熒光定量 PCR 儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。
（2） 按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。
| 反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | ROX 通道采集口蹄疫病毒熒光信號 FAM 通道采集塞內(nèi)卡病毒熒光信號 |
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PCR 反應(yīng)條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
| 反轉(zhuǎn)錄 | 50℃：10 分鐘（min） | 1 | |
| 預(yù)變性 | 95℃：3 分鐘（min） | 1 | |
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PCR 擴(kuò)增 | 95℃：5 秒（s） |
40 | |
| 55℃：40 秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI 系列熒光 PCR 儀在設(shè)置時不選 ROX 校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇 None。
【參考值（參考范圍）】
1. 試劑盒有效性判定：
（1） 陽性對照：有典型 S 型擴(kuò)增曲線或 Ct 值≤35。
（2） 陰性對照：Ct 值＞38 或無 Ct 值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。
2. 標(biāo)本結(jié)果判定：
（1） 陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果 Ct 值≤35 或有明顯指數(shù)增長期。
（2） 可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果 Ct 值在 35～38 范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Ct 值仍在35～ 38 范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3） 陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果 Ct 值＞38 或無 Ct 值。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
| 通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 | |
| ROX | FAM | |
| + | + | 標(biāo)本中檢出口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒 RNA |
| + | - | 標(biāo)本中檢出口蹄疫病毒 RNA，未檢出塞內(nèi)卡病毒 RNA |
| - | + | 標(biāo)本中檢出塞內(nèi)卡病毒 RNA，未檢出口蹄疫病毒 RNA |
| - | - | 標(biāo)本中未檢出口蹄疫病毒/塞內(nèi)卡病毒 RNA |
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成 RNA 降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最低檢出限為 103 Copies/mL，產(chǎn)品 CV 值≤3%。
【注意事項(xiàng)】
1. 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理；
2. 為避免 RNA 降解，樣本處理過程應(yīng)在 0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理；
3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺清潔；
4. 吸取反應(yīng)液時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時離心；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放；
7. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸 PCR 反應(yīng)管，并應(yīng)避免在 PCR 反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記；
8. 檢測過程中使用過的吸頭，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的 PCR 反應(yīng)管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒；
9. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。
