CellTiter-Lumi™ Steady發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(CellTiter-Lumi™ Steady Luminescent Cell Viability Assay Kit)，簡稱CTL Steady發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒或CTL Steady，是一種通過化學(xué)發(fā)光法測定細(xì)胞內(nèi)ATP含量從而用于超高信號穩(wěn)定性、超高靈敏度、超寬線性范圍定量檢測活細(xì)胞數(shù)目的試劑盒。本產(chǎn)品和同類產(chǎn)品相比，最大的特點是發(fā)光信號特別穩(wěn)定，1小時內(nèi)信號整體上下波動范圍通常不超過±10%，特別適用于待測樣品數(shù)量較多、耗時較長且須前后數(shù)據(jù)進(jìn)行比較的多孔板中細(xì)胞活力的大批量連續(xù)測定，也特別適用于高通量篩選(high-throughput screening)的自動化操作系統(tǒng)。

本產(chǎn)品的用途與同類產(chǎn)品CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(簡稱CTL Steady Plus)、CellTiter-Lumi™ Plus發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(簡稱CTL Plus)及CellTiter-Lumi™發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(簡稱CTL)，以及Promega公司的CellTiter-Glo® 2.0 Assay (簡稱CTG 2.0)、CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (簡稱CTG)類似。本產(chǎn)品用于HeLa細(xì)胞的檢測效果參考圖1A和圖1B。CTL Steady的化學(xué)發(fā)光信號的穩(wěn)定性和CTL Steady Plus接近，顯著優(yōu)于CTL (圖1D)，線性范圍和CTL相近，但發(fā)光強度稍低于CTL和CTL Steady Plus (圖1C)。

圖1. 本產(chǎn)品CellTiter-Lumi™ Steady發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(CTL Steady)和同類產(chǎn)品CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(CTL Steady Plus)、CellTiter-Lumi™發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(CTL)對HeLa細(xì)胞的檢測效果。圖A和圖B為CTL Steady對不同數(shù)量HeLa細(xì)胞在白色96孔板中的檢測效果，圖C為CTL Steady、CTL Steady Plus和CTL 對不同數(shù)量的HeLa細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光強度的檢測效果對比圖，圖D為CTL Steady、CTL Steady Plus和CTL對2.5萬個/孔HeLa細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定性的檢測效果對比圖。實際檢測效果會因細(xì)胞種類、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

本產(chǎn)品發(fā)光信號特別穩(wěn)定。本產(chǎn)品的發(fā)光信號穩(wěn)定性特別好，1小時內(nèi)信號整體上下波動范圍通常不超過±10%，在發(fā)光穩(wěn)定性方面顯著優(yōu)于同類產(chǎn)品CTL (圖1D)，特別適用于待測樣品數(shù)量較多的96孔板或384孔板中細(xì)胞活力的大批量連續(xù)測定。發(fā)光信號的穩(wěn)定性可能會因為細(xì)胞種類、細(xì)胞培養(yǎng)液、外界溫度等條件的不同而略有差異。例如對于貼壁的HeLa細(xì)胞，信號強度會隨著反應(yīng)時間的延長先升高再降低。而對于懸浮的如Jurkat細(xì)胞，信號強度則可能會隨著反應(yīng)時間的延長持續(xù)小幅度的降低，但是通常發(fā)光信號在60分鐘內(nèi)整體上下波動范圍不超過±10%，在120分鐘內(nèi)信號波動不超過±25% (圖1D)，信號半衰期長達(dá)5小時之久。

本產(chǎn)品檢測靈敏度高，線性范圍寬，可以在10個至5萬個細(xì)胞范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。使用本產(chǎn)品檢測的細(xì)胞數(shù)量僅為10個/孔時，發(fā)光強度可達(dá)空白孔的2倍左右。不同細(xì)胞的檢測數(shù)量上限會有顯著不同，對于一些ATP含量特別高的細(xì)胞，在細(xì)胞數(shù)量達(dá)到3萬個后可能會不呈現(xiàn)線性關(guān)系，但化學(xué)發(fā)光讀數(shù)還是會繼續(xù)升高的。如果檢測的細(xì)胞數(shù)量超過3萬，推薦使用發(fā)光信號同樣穩(wěn)定、但是檢測上限更高的CellTiter-Lumi™ Steady Plus發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(C0070)，或者考慮降低細(xì)胞接種時的密度。CellTiter-Lumi™系列各個產(chǎn)品的對比見下表：

本產(chǎn)品發(fā)光強度高。對于相同的細(xì)胞樣品，本產(chǎn)品的發(fā)光強度可以達(dá)到CTL的約50-70%，達(dá)到Steady Plus的60-80%，實際檢測效果會因細(xì)胞種類、細(xì)胞數(shù)量、檢測儀器等條件的不同而略有差異。

本產(chǎn)品操作簡單，讀數(shù)穩(wěn)定，檢測速度快，完成檢測僅需約10分鐘。本產(chǎn)品比常見的MTT、AlamarBlue、Calcein-AM、WST-1、CCK-8、CCK-F等其它細(xì)胞活力測定方法更加簡單快捷。只需把試劑盒提供的單一即用型試劑CellTiter-Lumi™ Steady發(fā)光法檢測試劑與培養(yǎng)細(xì)胞等體積混合，反應(yīng)10分鐘后即可進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。無需洗滌細(xì)胞，也無需更換或去除培養(yǎng)液。并且發(fā)光信號非常穩(wěn)定，通常1小時內(nèi)信號整體上下波動不超過±10%。

本產(chǎn)品穩(wěn)定性好。本試劑盒中的CellTiter-Lumi™ Steady發(fā)光法檢測試劑穩(wěn)定性好，反復(fù)凍融5次對檢測效果基本無影響，反復(fù)凍融10次檢測效果下降不超過10%。本產(chǎn)品4℃保存3天對檢測效果無顯著影響，4℃保存7天檢測效果下降不超過10%。室溫保存1天，仍可保留80%以上的檢測效果。37℃保存1天，可保留60%以上的檢測效果。本產(chǎn)品即使僅保留約50%的檢測效果，仍可以滿足各種常規(guī)檢測的要求。

本產(chǎn)品使用靈活便捷。不僅適合少量樣品的檢測，也非常適合大量樣品的高通量篩選(high-throughput screening)檢測。

ATP，作為最重要的能量分子，在細(xì)胞的各種生理、病理過程中起著重要作用。ATP是細(xì)胞新陳代謝的一個重要指標(biāo)，也是具有代謝活性細(xì)胞的重要標(biāo)志性分子，并和活細(xì)胞數(shù)目成良好的線性關(guān)系。因此，ATP含量能很好地反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)目，即本試劑盒可以通過測定ATP含量來進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)或檢測細(xì)胞活力。

本試劑盒通過ATP檢測細(xì)胞活力的原理參見圖2。借助ATP依賴的螢光素酶催化的螢光素發(fā)光反應(yīng)，ATP可以通過測定化學(xué)發(fā)光強度來進(jìn)行定量。由于ATP含量能很好地反映活細(xì)胞的數(shù)目，而ATP含量和化學(xué)發(fā)光強度成正比，這樣就可以簡單地通過化學(xué)發(fā)光強度來計算出細(xì)胞活力或細(xì)胞數(shù)目。

圖2. CellTiter-Lumi™ Steady發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒(CTL Steady)檢測ATP的原理圖。

各種細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑盒的比較和選擇，請參考http://www.beyotime.com/support/cell-proliferation.htm。

對于96孔板，推薦使用100μl細(xì)胞培養(yǎng)液和100μl的檢測試劑，總體積為200μl，此時本試劑盒每10ml可以進(jìn)行100次檢測。對于384孔板，推薦使用25μl細(xì)胞培養(yǎng)液和25μl的檢測試劑，總體積為50μl，此時本試劑盒每10ml可以進(jìn)行400次檢測。也可以用其它體積的試劑進(jìn)行檢測，但細(xì)胞培養(yǎng)液和檢測試劑體積的比例須為1:1。雖然有數(shù)據(jù)顯示適當(dāng)減少檢測試劑的用量也很可能會得到較好的結(jié)果，但對于細(xì)胞數(shù)量特別多、細(xì)胞數(shù)量特別少或者重復(fù)性要求比較高的情況，建議按照推薦用量進(jìn)行檢測。

包裝清單：

保存條件：

-20℃避光保存，至少一年有效。

注意事項：

螢光素酶的活性對溫度比較敏感，所以反應(yīng)前細(xì)胞和檢測試劑均需平衡至室溫后再進(jìn)行測定。可將檢測試劑在不超過25℃的室溫或20-25℃的水浴中融解并混勻后使用。

本試劑盒的檢測試劑中含有螢光素酶，反復(fù)凍融會導(dǎo)致其逐漸失活。盡管經(jīng)測試本試劑反復(fù)凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，為取得良好的使用效果，第一次解凍后可適當(dāng)分裝保存，但需注意分裝的容器不能有ATP污染。反復(fù)凍融過程中，可能會導(dǎo)致檢測試劑中出現(xiàn)少量沉淀，此時宜平衡至室溫，并盡量溶解。如仍有殘留的不溶物，可以離心去除后使用，經(jīng)測試不會影響后續(xù)的檢測效果。

待測藥物的溶劑含量較高時可能會干擾螢光素酶反應(yīng)，從而影響化學(xué)發(fā)光信號。可以通過設(shè)置含有溶劑的細(xì)胞培養(yǎng)液對照孔排除溶劑的干擾。經(jīng)測試，最終反應(yīng)體系中DMSO含量在2%以內(nèi)不會對反應(yīng)產(chǎn)生影響。

檢測時須使用適合于細(xì)胞培養(yǎng)的白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板，相鄰孔之間會產(chǎn)生相互干擾。推薦使用的BeyoGold™全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(FCP966)或BeyoGold™全白96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(FCP968)。

使用說明中提供了檢測ATP標(biāo)準(zhǔn)品的方法，實際檢測細(xì)胞相對活力時通常并不需要檢測ATP標(biāo)準(zhǔn)品。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.細(xì)胞的準(zhǔn)備：
使用適合進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測的96孔板，每孔接種100μl細(xì)胞(如使用384孔板，每孔接種25μl細(xì)胞，具體用量視不同類型的384孔板而定)，并確保檢測時每孔的細(xì)胞數(shù)量在3萬個以內(nèi)(如使用384孔板宜控制在6千個以內(nèi))，同時設(shè)置不含細(xì)胞的培養(yǎng)液孔作為陰性對照，按照細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞。如有需要，可加入藥物處理細(xì)胞。此外，如有必要，也可以設(shè)置細(xì)胞的濃度梯度，以便后續(xù)確定試劑盒的使用效果。
2.ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)置(選做)：
把自備的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻取３醮螜z測可以設(shè)置0、3、10、30、100、300、1000、3000nM這幾個濃度，96孔板每孔加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)品。如有必要，在后續(xù)的實驗中可以根據(jù)細(xì)胞中的ATP含量對標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。如果用細(xì)胞培養(yǎng)液來稀釋ATP標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋后需立即進(jìn)行后續(xù)的發(fā)光檢測，否則培養(yǎng)液中的ATPase等可以消耗ATP的酶會導(dǎo)致ATP含量下降。
3.檢測試劑的準(zhǔn)備：
a.融解凍存的CellTiter-Lumi™ Steady發(fā)光法檢測試劑，如有必要可適當(dāng)分裝該試劑。經(jīng)測試反復(fù)凍融5次對其檢測效果無顯著影響。
b.按照96孔板每孔100μl (384孔板每孔25μl)的量，取適量CellTiter-Lumi™ Steady發(fā)光法檢測試劑，平衡至室溫。
4.細(xì)胞活力檢測：
a.取出細(xì)胞培養(yǎng)板在室溫平衡10分鐘(通常不宜超過30分鐘)。
b.96孔板每孔加入100μl CellTiter-Lumi™ Steady發(fā)光法檢測試劑(384孔板每孔25μl)。
c.室溫振蕩2分鐘，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解。
d.室溫(約25℃)孵育10分鐘，使發(fā)光信號趨于穩(wěn)定。
e.使用具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。請根據(jù)儀器要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，每個孔的檢測時間一般為0.25-1秒或更長時間，具體需根據(jù)儀器的檢測靈敏度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
f.根據(jù)化學(xué)發(fā)光讀數(shù)直接計算細(xì)胞的相對活力，或根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出ATP的量從而計算出細(xì)胞的相對活力。對于培養(yǎng)細(xì)胞和ATP標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果可以參考圖1和圖3，細(xì)胞在0-30,000個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，ATP標(biāo)準(zhǔn)品0-10,000nM濃度范圍有良好的線性關(guān)系。注：檢測效果因細(xì)胞的種類不同而有所不同，對于一些ATP含量特別高的細(xì)胞，在細(xì)胞數(shù)量達(dá)到30,000個后可能會不呈現(xiàn)線性相關(guān)，但化學(xué)發(fā)光讀數(shù)還是會繼續(xù)升高的。
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