Probe One-Step qRT-PCR Kit是一種基于TaqMan等探針的用于一步法反轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR，即qRT-PCR(Quantitative Reverse Transcription PCR)或real-time RT-PCR的高品質(zhì)預(yù)混液，主要用于RNA的特異性超高靈敏度定量檢測。由于使用的探針一般是TaqMan探針，所以本方法也常稱作TaqMan探針法。
Probe One-Step qRT-PCR Kit以提取的RNA為模版，使用qPCR引物在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR，操作簡單快速，最大限度地減少人為誤差，有效降低污染風(fēng)險，節(jié)約PCR實(shí)驗(yàn)的操作時間，檢測通量大。
本產(chǎn)品整合了高效的 M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor和優(yōu)異的抗體結(jié)合型熱啟動 Taq DNA Polymerase，并優(yōu)化了緩沖體系，反轉(zhuǎn)錄性能優(yōu)、檢測靈敏度高、擴(kuò)增特異性強(qiáng)、反應(yīng)穩(wěn)定性好，非常適合于內(nèi)源低豐度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的檢測。
檢測原理：探針法qPCR不使用熒光染料如SYBR Green等對PCR產(chǎn)物進(jìn)行熒光染色，而是采用了熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)(quencher)標(biāo)記的DNA探針靶向擬通過PCR檢測的目標(biāo)序列(設(shè)計的探針結(jié)合位點(diǎn)通常位于兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間)。正常情況下，探針上的淬滅基團(tuán)由于空間上的熒光共振能力轉(zhuǎn)移(FRET)而導(dǎo)致熒光基團(tuán)淬滅。在PCR反應(yīng)擴(kuò)增目標(biāo)序列時，引物和探針都會退火到目標(biāo)基因上，隨著引物的延伸，Taq酶的5'→3'外切酶活性會導(dǎo)致結(jié)合在目標(biāo)序列上的探針從5’端開始逐漸被降解。探針的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)被Taq酶切開后，淬滅基團(tuán)的作用消失，熒光基團(tuán)就能正常地被激發(fā)光所激發(fā)而產(chǎn)生熒光了。每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，就會有更多的熒光基團(tuán)被釋放，熒光強(qiáng)度與新合成的目標(biāo)片段數(shù)量成正比，從而就可以實(shí)現(xiàn)定量檢測了。探針通常是目標(biāo)序列特異性的一段線性DNA，5'端標(biāo)記FAM或HEX等熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記BHQ1、TAMRA或MGB等熒光淬滅基團(tuán)。
本產(chǎn)品的特異性好、靈敏度高：特異性并不僅僅依賴于PCR引物，探針和目標(biāo)基因發(fā)生特異性的結(jié)合和降解，才能生成熒光信號，檢測靈敏度和特異性通常要顯著高于使用SYBR Green等熒光染料的方法。
本產(chǎn)品可用于多重檢測：單個反應(yīng)孔中，不同基因?qū)��?yīng)不同探針，不同探針對應(yīng)不同熒光標(biāo)記，即可進(jìn)行多重?zé)晒舛�量PCR檢測。經(jīng)測試，在適當(dāng)優(yōu)化引物和探針后，本產(chǎn)品可同時用于2-3個基因的檢測。
本產(chǎn)品使用的Taq DNA Polymerase是一種與抗體結(jié)合的高品質(zhì)熱啟動酶，能夠?qū)崿F(xiàn)便捷高效的熱啟動。Taq DNA Polymerase中的Taq酶與抗Taq酶的單克隆抗體相互結(jié)合，從而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，這樣可以有效避免在低溫條件下由引物和模板DNA非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)的預(yù)變性步驟中抗體會被加熱失活，這樣可以確保僅在預(yù)變性后才會把Taq酶的活性釋放出來，預(yù)變性之前不會發(fā)生DNA聚合反應(yīng)，從而大大提高了PCR反應(yīng)的特異性、靈敏度和定量檢測的準(zhǔn)確性。
本產(chǎn)品包含了 M-MuLV Reverse Transcriptase、Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、穩(wěn)定劑、Nuclease-free Water、ROX (根據(jù)不同熒光定量PCR儀進(jìn)行選擇)和鎂離子等所有的通用組分，使操作更簡單、使用更便捷。用戶只需自備引物、探針和樣品RNA即可。
本產(chǎn)品提供了Low ROX和High ROX，廣泛兼容于無需ROX和需要Low ROX或High ROX作為校正染料的熒光定量PCR儀。ROX的作用是用于校正與PCR無關(guān)的熒光波動，從而最大限度減少孔間差異。這種差異可能由多種因素引起，如移液誤差及樣品蒸發(fā)等。不同的熒光定量PCR儀對ROX的要求不同，請根據(jù)實(shí)際所用儀器在配制反應(yīng)體系時選擇高濃度ROX (High ROX)、低濃度ROX (Low ROX)或不加ROXProbe。Probe常用儀器所需ROX類型請參考如下表格。

如果用于常規(guī)的96孔板qRT-PCR檢測(建議反應(yīng)體系為20µl)，本產(chǎn)品小包裝D7277S可以進(jìn)行100次檢測，中包裝D7277M可進(jìn)行500次檢測；如果用于常規(guī)的384孔板qRT-PCR檢測(建議反應(yīng)體系為10µl)，本產(chǎn)品小包裝D7277S可以進(jìn)行200次檢測，中包裝D7277M可進(jìn)行1000次檢測。
包裝清單：

保存條件：
-20℃避光保存，兩年有效。盡量避免反復(fù)凍融。
注意事項：
探針的熒光標(biāo)記須根據(jù)所使用的qPCR儀熒光兼容性來確定。對于需要ROX作為校正染料的熒光定量PCR儀，避免使用ROX標(biāo)記探針。
用于多重檢測時，需要適當(dāng)優(yōu)化引物和探針，并使用適當(dāng)?shù)牟煌瑹晒饣鶊F(tuán)標(biāo)記探針，確定效果后再進(jìn)行多重檢測，一般建議不超過三重檢測。
請注意避免RNase污染，使用RNase-free的槍頭、離心管等。
Probe One-Step Enzyme Mix (10X)含有高濃度甘油，粘度高，使用前將短暫離心至管底，并用移液器輕輕混勻，混勻過程中盡量避免產(chǎn)生氣泡，然后緩慢準(zhǔn)確吸取。
使用前需確保Probe One-Step Reaction Buffer (2X)完全融化，上下顛倒輕輕混勻后使用。
如果擴(kuò)增片段較長或者RNA結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，可將模板RNA在65℃預(yù)處理5-10分鐘，可提高反轉(zhuǎn)錄效率。
本反應(yīng)使用qPCR的Reverse Primer作為反轉(zhuǎn)錄的基因特異性引物，不能使用Random Hexamer Primer或Oligo(dT) Primer等常用于cDNA第一鏈合成的引物。
注意引物退火溫度，當(dāng)退火溫度<60℃時，推薦使用三步法PCR擴(kuò)增。
對于超過350bp或者高GC含量的擴(kuò)增片段，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴(kuò)增效率。
經(jīng)測試，本產(chǎn)品反復(fù)凍融10次對使用效果無顯著影響。但仍需盡量避免反復(fù)凍融本產(chǎn)品，反復(fù)凍融可能使產(chǎn)品性能下降。
qPCR檢測是超高靈敏度的檢測，PCR反應(yīng)設(shè)置區(qū)域需盡量避免各種可能的待擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。PCR產(chǎn)物宜密封后丟棄，以避免超高濃度的PCR產(chǎn)物污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.One-Step qRT-PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
a.融解并混勻One-Step qRT-PCR反應(yīng)所需的各種溶液，置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b.參考下表在室溫或冰浴上設(shè)置One-Step qRT-PCR反應(yīng)體系(以96孔板，每孔反應(yīng)體系為20μl為例)：

注意：
(1)當(dāng)檢測樣品比較多時，可根據(jù)樣品數(shù)量先配制所需的相同試劑的混合液，一般多配制5-10%，然后再分裝到每個反應(yīng)孔中，最后再在每個反應(yīng)孔中加入不同的試劑，這樣可使所取的試劑體積更準(zhǔn)確更均一，誤差更小，并減少試劑損失。例如：檢測的目的RNA相同，而RNA樣品不同，則可以把除RNA樣品外的所有試劑根據(jù)樣品數(shù)量配制在一起，然后分液至每個反應(yīng)孔中，最后再加入不同的模板RNA。
(2)通常引物的終濃度為0.2-0.5μM時可獲得良好的檢測效果，也可根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。
(3)最佳的探針(probe)濃度，與使用的熒光定量PCR儀、探針種類、熒光標(biāo)記物質(zhì)種類有關(guān)。實(shí)際使用時請參考儀器說明書，或各熒光探針的具體使用要求進(jìn)行探針濃度的調(diào)節(jié)。通常探針的濃度宜低于引物的濃度，例如引物終濃度為0.3μM ，則推薦的探針終濃度為0.2μM，可在0.1-0.3μM范圍內(nèi)調(diào)整探針的終濃度。
(4)通常RNA模板的量以1pg-2µg為參考用量，一般總RNA為100ng-1µg。因不同物種的模板中含有RNA的拷貝數(shù)不同，如有必要，可對模板RNA進(jìn)行梯度稀釋，以確定最佳的模板RNA使用量。同時，由于qPCR靈敏度極高, 建立反應(yīng)體系時加入RNA模板量的準(zhǔn)確程度對最終定量結(jié)果會有很大的影響，因此建議將模板RNA適當(dāng)稀釋后加入反應(yīng)體系中，比如每個20μl反應(yīng)體系2-5µl，這樣可以有效提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。
(5)不同的熒光定量PCR儀對ROX的要求不同，請根據(jù)實(shí)際所用儀器在配制反應(yīng)體系時選擇高濃度ROX (High ROX)、低濃度ROX (Low ROX)或不加ROX。
(6)96孔板的推薦反應(yīng)體系為20µl，也可以根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求，按比例擴(kuò)大或縮小反應(yīng)體系。
(7)建議設(shè)置不加模板RNA的陰性對照組。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d.將設(shè)置好的PCR反應(yīng)管或PCR反應(yīng)板置于熒光定量PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2.One-Step qRT-PCR反應(yīng)程序：
50℃ 15分鐘一般可以得到理想的反轉(zhuǎn)錄效果，但如果片段較長，也可以增加至30分鐘。在Real-time PCR反應(yīng)前進(jìn)行模板的預(yù)變性，通常設(shè)定為95℃ 2分鐘，復(fù)雜或高GC模板適當(dāng)延長時間至5分鐘。本產(chǎn)品中的Taq DNA Polymerase可以在15秒內(nèi)可完成至少300bp的擴(kuò)增，可以滿足絕大多數(shù)的qPCR實(shí)驗(yàn)；對于超過350bp或者高GC含量的擴(kuò)增子，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴(kuò)增效率。建議采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT熒光定量PCR儀為例：
a.反轉(zhuǎn)錄：50℃ 15-30min
b.預(yù)變性：95℃ 2min
c.變性：95℃ 15sec
d.退火/延伸：60℃ 15-30sec
e.重復(fù)步驟c和步驟d，總共40個循環(huán)
f.熔解曲線分析(可選)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec
g.使用熒光定量PCR儀提供的軟件分析結(jié)果
三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，隨后重復(fù)步驟c、d及增加的這一步驟共40個循環(huán)即可。
注：以上舉例為常規(guī)qPCR反應(yīng)系統(tǒng)，僅供參考。實(shí)際反應(yīng)條件因模板、引物等的結(jié)構(gòu)不同而各異，需根據(jù)模板、引物、目的片段的特點(diǎn)設(shè)定最佳反應(yīng)條件，并根據(jù)比例放大或縮小反應(yīng)體系。

常見問題：
1.熒光定量PCR結(jié)果不理想，出現(xiàn)特異性不好或擴(kuò)增效率不高時，可能是由于以下原因造成：
a.樣品RNA發(fā)生降解。此時可以通過RNA電泳等方法確認(rèn)所使用的RNA樣品是否發(fā)生明顯的降解，在反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前的實(shí)驗(yàn)操作過程中需要嚴(yán)格注意無RNA酶的實(shí)驗(yàn)操作。
b.引物設(shè)計不佳。請選擇適當(dāng)?shù)囊�物設(shè)計軟件進(jìn)行引物設(shè)計，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。也可以嘗試使用有文獻(xiàn)報道使用過的引物，或者從訂購經(jīng)過測試的qPCR引物。
c.待擴(kuò)增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時宜更換引物。
d.PCR反應(yīng)體系在室溫設(shè)置時容易導(dǎo)致非特異性條帶，但在使用熱啟動酶時可以有效避免室溫操作導(dǎo)致的非特異性條帶的產(chǎn)生。但對于一些較難擴(kuò)增的產(chǎn)物，可以嘗試在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系，以進(jìn)一步減少非特異性的DNA擴(kuò)增。
e.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。這種情況下宜更換引物。
f.待擴(kuò)增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。此時宜更換引物，使待擴(kuò)增片段的GC含量和長度適中。
g.模板量太低，此時宜適當(dāng)加大模板量。
h.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
2.反應(yīng)條件優(yōu)化方法：
a.引物濃度：通常引物終濃度為0.2μM時可獲得良好檢測效果，終濃度可以在0.1-1.0μM范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整。如果希望提高反應(yīng)特異性，可降低引物濃度；如果希望提高擴(kuò)增效率，可增加引物的濃度，從而優(yōu)化反應(yīng)體系。
b.退火溫度：建議采用兩步法PCR，退火溫度60℃進(jìn)行反應(yīng)。如果希望提高反應(yīng)特異性，可提高退火溫度，以60-64℃作為退火溫度的調(diào)整范圍。在引物Tm值較低而得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時，可嘗試進(jìn)行三步法PCR擴(kuò)增，三步法的退火溫度請以56-64℃作為溫度設(shè)置的參考范圍。
c.延伸時間：建議采用兩步法PCR，延伸15-30秒。對于超過350bp或者高GC含量的擴(kuò)增子，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴(kuò)增效率。

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