Probe qPCR Mix (2X, Low ROX)是一種基于TaqMan等探針的用于實時熒光定量PCR，即探針法qPCR(Quantitative PCR)或real-time PCR的高品質預混液，主要用于cDNA和基因組DNA等的特異性超高靈敏度定量檢測。由于使用的探針一般是TaqMan探針，所以本方法也常稱作TaqMan探針法。

本產品特別適合用于低豐度或高特異性的目的基因的定量或定性檢測。例如一些低豐度的mRNA、lncRNA、小RNA、微生物RNA反轉錄后的高靈敏度檢測，一些相似度較高的常規染料法難以區分的同源基因或者基因的SNP檢測。
檢測原理：探針法qPCR不使用熒光染料如SYBR Green等對PCR產物進行熒光染色，而是采用了熒光基團和淬滅基團(quencher)標記的DNA探針靶向擬通過PCR檢測的目標序列(設計的探針結合位點通常位于兩條引物結合位點之間)。正常情況下，探針上的淬滅基團由于空間上的熒光共振能力轉移(FRET)而導致熒光基團淬滅。在PCR反應擴增目標序列時，引物和探針都會退火到目標基因上，隨著引物的延伸，Taq酶的5'→3'外切酶活性會導致結合在目標序列上的探針從5’端開始逐漸被降解。探針的熒光基團和淬滅基團被Taq酶切開后，淬滅基團的作用消失，熒光基團就能正常地被激發光所激發而產生熒光了。每經過一個PCR循環，就會有更多的熒光基團被釋放，熒光強度與新合成的目標片段數量成正比，從而就可以實現定量檢測了。探針通常是目標序列特異性的一段線性DNA，5'端標記FAM或HEX等熒光基團，3'端標記BHQ1、TAMRA或MGB等熒光淬滅基團。
本產品的特異性好、靈敏度高：特異性并不僅僅依賴于PCR引物，還依賴于探針的特異性，探針和目標基因發生特異性的結合和降解，才能生成熒光信號，檢測靈敏度和特異性通常要顯著高于使用SYBR Green等熒光染料的方法。
本產品可用于多重檢測：單個反應孔中，不同基因對應不同探針，不同探針對應不同熒光標記，即可進行多重熒光定量PCR檢測。經測試，在適當優化引物和探針后，本產品可同時用于2-3個基因的檢測。
本產品使用的 Taq DNA Polymerase是一種與抗體結合的高品質熱啟動酶，能夠實現便捷高效的熱啟動。 Taq DNA Polymerase中的Taq酶與抗Taq酶的單克隆抗體相互結合，從而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，這樣可以有效避免在低溫條件下由引物和模板DNA非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增。在PCR反應的預變性步驟中抗體會被加熱失活，這樣可以確保僅在預變性后才會把Taq酶的活性釋放出來，預變性之前不會發生DNA聚合反應，從而大大提高了PCR反應的特異性、靈敏度和定量檢測的準確性。
本產品包含了Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、穩定劑和鎂離子等所有的通用組分，使操作更簡單、使用更便捷。用戶只需自備引物、探針、樣品DNA和去離子水即可。
本產品含低濃度ROX，適用于需低濃度ROX作為校正染料的熒光定量PCR儀。ROX的作用是用于校正與PCR無關的熒光波動，從而最大限度減少孔間差異。這種差異可能由多種因素引起，如移液誤差及樣品蒸發等。不同的熒光定量PCR儀對ROX的要求不同，請根據實際所用儀器選擇含高濃度ROX (High ROX)、低濃度ROX (Low ROX)或不含ROX的Probe qPCR Mix (2X)。通常含高濃度ROX的Probe qPCR Mix (2X, High ROX)也可以用于不需要ROX或需要低濃度ROX的熒光定量PCR儀。常用儀器所需ROX類型請參考如下表格。

本產品如果用于常規的96孔板qPCR檢測(建議反應體系為20µl)，每毫升本產品可以進行100次檢測；如果用于常規的384孔板qPCR檢測(建議反應體系為10µl)，每毫升本產品可以進行200次檢測。
包裝清單：

保存條件：
-20℃避光保存，一年有效； 4℃避光保存，一個月內有效。盡量避免反復凍融。
注意事項：
探針的熒光標記須根據所使用的qPCR儀熒光兼容性來確定。對于需要ROX作為校正染料的熒光定量PCR儀，避免使用ROX標記探針。
用于多重檢測時，需要適當優化引物和探針，并使用適當的不同熒光基團標記探針，確定效果后再進行多重檢測，一般建議不超過三重檢測。
使用前需確保整管試劑完全融化，上下顛倒輕輕混勻后使用。混勻過程中盡量避免產生氣泡。
注意引物退火溫度，當退火溫度<60℃時，推薦使用三步法PCR擴增。
對于超過350bp或者高GC含量的擴增片段，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴增效率。
經測試，本產品反復凍融10次對使用效果無顯著影響。但仍需盡量避免反復凍融本產品，反復凍融可能使產品性能下降。
qPCR檢測是超高靈敏度的檢測，PCR反應設置區域需盡量避免各種可能的待擴增產物的污染。PCR產物宜密封后丟棄，以避免超高濃度的PCR產物污染實驗環境。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.PCR反應體系的設置：
a.融解并混勻PCR反應所需的各種溶液。 Probe qPCR Mix (2X, Low ROX)完全融解并混勻后置于冰浴上或冰盒內。
b.參考下表在室溫或冰浴上設置PCR反應體系(以96孔板為例)：

注意：(1) 通常引物的終濃度為0.2-0.5μM時可獲得良好的檢測效果，也可根據情況在0.1-1.0μM范圍內調整引物的終濃度。
(2) 最佳的探針(probe)濃度，與使用的熒光定量PCR儀、探針種類、熒光標記物質種類有關。實際使用時請參考儀器說明書，或各熒光探針的具體使用要求進行探針濃度的調節。通常探針的濃度宜低于引物的濃度，例如引物終濃度為0.3μM ，則推薦的探針終濃度為0.2μM，可在0.1-0.3μM范圍內調整探針的終濃度。
(3) 通常DNA模板的量以1-10ng cDNA或10-100ng基因組DNA為參考用量。因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數不同，如有必要，可對模板進行梯度稀釋，以確定最佳的模板使用量。RT-PCR反應得到的cDNA直接作為模板時，其添加量不要超過PCR反應總體積的10%。
(4) 96孔板的推薦反應體系為20µl，也可以根據實際實驗需求，按比例擴大或縮小反應體系。
(5) 建議設置不加模板的陰性對照組。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數秒，使液體積聚于管底。
d.將設置好的PCR反應管或PCR反應板置于熒光定量PCR儀上，開始PCR反應。
2.PCR反應程序：
在Real-time PCR反應前進行模板的預變性，通常設定為95℃ 2分鐘，復雜或高GC模板適當延長時間至5分鐘。本產品中的 Taq DNA Polymerase可以在15秒內可完成至少300bp的擴增，可以滿足絕大多數的qPCR實驗；對于超過350bp或者高GC含量的擴增子，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴增效率。建議采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT熒光定量PCR儀為例：
a.預變性：95℃ 2min
b.變性：95℃ 15sec
c.退火/延伸：60℃ 15-30sec
d.重復步驟b和步驟c，總共40個循環
e.熔解曲線分析(可選)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec
f.使用熒光定量PCR儀提供的軟件分析結果
三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，隨后重復步驟b、c及增加的這一步驟共40個循環即可。
注：以上舉例為常規qPCR反應系統，僅供參考。實際反應條件因模板、引物等的結構不同而各異，需根據模板、引物、目的片段的特點設定最佳反應條件，并根據比例放大或縮小反應體系。

常見問題：
1.熒光定量PCR結果不理想，出現特異性不好或擴增效率不高時，可能是由于以下原因造成：
a.引物設計不佳。請選擇適當的引物設計軟件進行引物設計，注意引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。也可以嘗試使用有文獻報道使用過的引物，或者從訂購經過測試的qPCR引物。
b.待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時宜更換引物。
c.PCR反應體系在室溫設置時容易導致非特異性條帶，但在使用熱啟動酶時可以有效避免室溫操作導致的非特異性條帶的產生。但對于一些較難擴增的產物，可以嘗試在冰浴上設置PCR反應體系，以進一步減少非特異性的DNA擴增。
d.退火溫度不佳，需要優化。這種情況下宜更換引物。
e.待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。此時宜更換引物，使待擴增片段的GC含量和長度適中。
f.模板量太低，此時宜適當加大模板量。
g.模板中含有抑制PCR反應的物質，可以用適當的DNA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
2.反應條件優化方法：
a.引物濃度：通常引物終濃度為0.3μM時可獲得良好檢測效果，終濃度可以在0.1-1.0μM范圍內適當調整。如果希望提高反應特異性，可降低引物濃度；如果希望提高擴增效率，可增加引物的濃度，從而優化反應體系。
b.探針濃度：通常探針終濃度為0.2μM時可獲得良好檢測效果，終濃度可以在0.1-0.5μM范圍內適當調整，但不宜超過引物的終濃度。
c.退火溫度：建議采用兩步法PCR，退火溫度60℃進行反應。如果希望提高反應特異性，可提高退火溫度，以60-64℃作為退火溫度的調整范圍。在引物Tm值較低而得不到良好的實驗結果時，可嘗試進行三步法PCR擴增，三步法的退火溫度請以56-64℃作為溫度設置的參考范圍。
d.延伸時間：建議采用兩步法PCR，延伸15-30秒。對于超過350bp或者高GC含量的擴增子，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴增效率。

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