pCMV-jGCaMP7系列質(zhì)粒(jGCaMP7b/jGCaMP7c/jGCaMP7f/jGCaMP7s)是用于鈣離子(Ca2+)熒光檢測(cè)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)的是經(jīng)過突變和優(yōu)化并適用于細(xì)胞或組織中鈣離子熒光檢測(cè)的M13-GFP-CaM融合蛋白。M13-GFP-CaM融合蛋白這個(gè)鈣離子探針(calcium probe)中，環(huán)狀排列的綠色熒光蛋白(circularly permuted green fluorescent protein, cpGFP)一端和鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)融合表達(dá)，另一端與可以和鈣調(diào)蛋白CaM相互作用的肌球蛋白輕鏈激酶M13 (也稱RS20)肽鏈融合表達(dá)。這樣當(dāng)鈣離子結(jié)合鈣調(diào)蛋白時(shí)，可以改變鈣調(diào)蛋白的構(gòu)象，同時(shí)也會(huì)影響和鈣調(diào)蛋白相互作用的M13的構(gòu)象，鈣調(diào)蛋白和M13的構(gòu)象改變最終導(dǎo)致GFP的構(gòu)象改變，從而影響其熒光的強(qiáng)弱，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)于鈣離子濃度變化的檢測(cè)。
圖1. GCaMP7系列蛋白結(jié)構(gòu)圖。其中pRSET A Tag中含有6X His tag。
pCMV-jGCaMP7系列質(zhì)粒(jGCaMP7b/jGCaMP7c/jGCaMP7f/jGCaMP7s)是最新一代基因編碼的鈣離子探針系列，適用于常見細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平變化檢測(cè)，并且特別適合用于監(jiān)測(cè)特定條件下神經(jīng)元中的鈣離子水平的變化。
jGCaMP7系列的四個(gè)融合蛋白與GCaMP6系列相比，各有其突出特點(diǎn)：高亮度鈣離子熒光探針jGCaMP7b (brighter baseline fluorescence)有更亮的本底熒光，并且靈敏度可達(dá)到GCaMP6s的3倍，未結(jié)合鈣離子時(shí)的熒光強(qiáng)度比GCaMP6s增強(qiáng)50%；高對(duì)比度鈣離子熒光探針jGCaMP7c (high contrast with low baseline fluorescence)有高對(duì)比度低和更低的背景熒光，并且靈敏度是GCaMP6s的2.7倍，對(duì)比度顯著增強(qiáng)；快速響應(yīng)型鈣離子熒光探針jGCaMP7f (fast kinetics)具有快速動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，反應(yīng)速率是GCaMP6f的5倍和GCaMP6s的3倍，更加適合檢測(cè)鈣離子的動(dòng)態(tài)變化；高靈敏度鈣離子熒光探針jGCaMP7s (sensitive and slow) 具有高靈敏度但響應(yīng)速度相對(duì)較慢的特點(diǎn)，靈敏度可達(dá)GCaMP6s的5倍以上，并且響應(yīng)速率也比GCaMP6s快。
pCMV-jGCaMP7系列質(zhì)粒是在針對(duì)其M13-GFP-CaM融合蛋白中肽鏈相互作用的界面區(qū)域進(jìn)行突變篩選并優(yōu)化而得到的。四個(gè)融合蛋白對(duì)應(yīng)的突變氨基酸序列參考表1。
表1：jGCaMP7突變位點(diǎn)
| M13 | Linker1 | cpGFP | Linker2 | CaM | ||||||
| jGCaMP7s | A52V | A317L | ||||||||
| jGCaMP7f | H78K | A317L | R381T | T383S | G392R | |||||
| jGCaMP7b | H78K | L302P | A317L | M374Y | ||||||
| jGCaMP7c | L59Q | E60P | H78K | M378G | K379S | T383S | T412N | |||
jGCamP7b中的突變主要發(fā)生在cpGFP(H78K)、Linker2(L302P)和CaM(A317L/M374Y)上。pCMV-jGCaMP7b質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子，可以高效啟動(dòng)目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)，該質(zhì)粒為卡那霉素抗性。
pCMV- jGCaMP7b質(zhì)粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| CMV promoter | 1-602 |
| T3 promoter and T3 primer binding site | 620-639 |
| jGCaMP7b | 693-2045 |
| T7 promoter and T7 primer binding site | 2107-2128 |
| SV40 polyA signal | 2140-2523 |
| f1 origin of ss-DNA replication | 2661-2965 |
| bla promoter | 2990-3114 |
| SV40 promoter | 3134-3427 |
| Neomycin/kanamycin resistance ORF | 3507-4298 |
| HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal | 4299-4757 |
| pUC origin | 4886-5553 |
pCMV- jGCaMP7b質(zhì)粒(5605bp)的圖譜如下：
pCMV-jGCaMP7b質(zhì)粒的詳細(xì)圖譜見說明書：https://www.beyotime.com/Manual/D2861 pCMV-jGCamP7b.pdf。
pCMV-jGCaMP7b中沒有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pCMV-jGCaMP7b)包括：
| AclI | AfeI | AgeI | AhdI | AscI | AsiSI | BaeI |
| BbsI | BbvCI | BglII | BsiWI | BsmBI | BspEI | BssHII |
| BstEII | BstZ17I | EcoNI | EcoRI | EcoRV | Esp3I | FseI |
| HindIII | NruI | PflMI | PmeI | PpuMI | PshAI | PspXI |
| SbfI | ScaI | SgrAI | SwaI | XcmI | XmnI |
pCMV-jGCaMP7b中的單酶切位點(diǎn)（Restriction enzymes that cut pCMV-jGCaMP7b once）包括：
| AccI | GT`MK,AC | 799 | PflFI | GACN`N,NGTC | 3735 |
| AflII | C`TTAA,G | 1536 | PluTI | G,GCGC`C | 3638 |
| ApaI | G,GGCC`C | 2062 | PmlI | CAC|GTG | 1919 |
| ApaLI | G`TGCA,C | 5239 | PspOMI | G`GGCC,C | 2058 |
| BamHI | G`GATC,C | 687 | PstI | C,TGCA`G | 1744 |
| BcgI | NN` (N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN | 735 | PvuI | CG,AT`CG | 2140 |
| BlpI | GC`TNAGC | 858 | RsrII | CG`GWC,CG | 4151 |
| BmgBI | CAC|GTC | 810 | SacII | CC,GC`GG | 662 |
| Bpu10I | CC`TNA,GC | 1029 | SalI | G`TCGA,C | 798 |
| BsaXI | ,NNN` (N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN` | 2687 | SapI | GCTCTTCN`NNN, | 1609 |
| BspQI | GCTCTTCN`NNN, | 1609 | SfiI | GGCCN,NNN`NGGCC | 3410 |
| CspCI | ,NN` (N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` | 382 | SfoI | GGC|GCC | 3636 |
| DraIII | CAC,NNN`GTG | 2753 | SmaI | CCC|GGG | 682 |
| KasI | G`GCGC,C | 3634 | SnaBI | TAC|GTA | 342 |
| MfeI | C`AATT,G | 2837 | SpeI | A`CTAG,T | 2052 |
| MluI | A`CGCG,T | 2523 | SrfI | GCCC|GGGC | 682 |
| MscI | TGG|CCA | 3717 | StuI | AGG|CCT | 3456 |
| NarI | GG`CG,CC | 3635 | TspMI | C`CCGG,G | 680 |
| NdeI | CA`TA,TG | 240 | Tth111I | GACN`N,NGTC | 3753 |
| NotI | GC`GGCC,GC | 668 | XbaI | T`CTAG,A | 2046 |
| PaeR7I | CTCGAG | 867 | XhoI | C`TCGA,G | 867 |
| PciI | A`CATG,T | 5553 | XmaI | C`CCGG,G | 680 |
pCMV-jGCaMP7b的全序列信息:D2861PCMV-jGCaMP7b序列.txt
pCMV-jGCaMP7b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞12h后，于培養(yǎng)基中加入Ionomycin (2μM)后150秒內(nèi)的熒光變化效果請(qǐng)參考圖2本產(chǎn)品網(wǎng)站上的視頻。
圖2. pCMV-jGCaMP7b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞12h后2μM Ionomycin處理前后的熒光變化效果圖。pCMV-jGCaMP7b質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)在六孔板中的Hela細(xì)胞12h后，先用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，加入1ml DMEM，選擇適當(dāng)視野，在熒光顯微鏡下拍攝視頻。開始拍攝5-10秒后，加入1ml含有4μM Ionomycin的新鮮DMEM培養(yǎng)液(最終濃度為2μM Ionomycin)，繼續(xù)拍攝視頻約2-3分鐘。圖中可見加入Ionomycin之前很細(xì)胞的熒光比較弱，加入Ionomycin后細(xì)胞的熒光逐漸變強(qiáng)，時(shí)間較長(zhǎng)后熒光又會(huì)逐漸變?nèi)酢. 未加Ionomycin；B. 加入Ionomycin 30s；C：加入Ionomycin 60s；D：加入Ionomycin 120s。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D2861-1µg | pCMV-jGCaMP7b(高亮度鈣離子熒光探針) | 1µg |
| D2861-100µg | pCMV-jGCaMP7b(高亮度鈣離子熒光探針) | 100µg |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
本質(zhì)粒未經(jīng)碧云天書面許可不得用于任何商業(yè)用途，也不得移交給訂貨人所在實(shí)驗(yàn)室外的任何個(gè)人或單位。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
