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pAdEasy-1/BJ5183 甘油菌(腺病毒重組配套菌)

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 pShuttle-CMV-C-DsRed (腺病毒質粒, 紅色熒光)是自行研發的用于構建表達C端DsRed(紅色熒光蛋白)融合蛋白的重組腺病毒包裝用的穿梭質粒。本穿梭質粒構建后,需要和預轉染了pAdEasy-1質粒的BJ5183菌株(D8107)以及重組腺病毒包裝細胞配合使用才能完成重組腺病毒的包裝。

pShuttle-CMV-C-DsRed質粒可以用于在包裝成腺病毒后表達C端含DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein,香菇珊瑚紅色熒光蛋白)標簽的融合蛋白。該質粒含有CMV啟動子,可以高效啟動目的蛋白在細胞中的表達。在多克隆位點的后面有一個DsRed的完整編碼序列,因此在多克隆位點根據閱讀框插入目的基因就可以表達C端含有DsRed標簽的融合蛋白。利用DsRed的熒光特性可以比較容易地觀察融合蛋白的表達水平和細胞內定位,也可以利用DsRed抗體來檢測或免疫沉淀融合蛋白。DsRed與GFP沒有序列同源性,不能使用GFP抗體檢測DsRed。

本質粒為卡那霉素抗性。

重組腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一種常見的用于在培養細胞或動物體內表達外源基因的重要工具。重組腺病毒具有感染宿主細胞范圍廣、感染不依賴細胞分裂、高滴度及目的基因表達水平高等特性。最常用的腺病毒載體是人類血清5型腺病毒。改造后的人類血清5型腺病毒,刪除了在病毒裝配過程中起關鍵作用的E1基因和非必須的能表達逃避宿主免疫的E3基因,E1和E3基因的刪除使得重組腺病毒不能自我復制,同時給外源基因的插入提供了空間,最長可插入7.5kb的外源基因。從而提高了重組腺病毒的的安全性和可操作性。再利用攜帶E1基因的AD-293、293A、HEK293等細胞作為包裝細胞就可以完成重組腺病毒的包裝。

pShuttle系列的穿梭質粒攜帶外源目的基因,經過Pme I線性化,隨后與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1(D8106)共轉化到大腸桿菌BJ5183中,或者轉化到已經預轉化了pAdEasy-1質粒的BJ5183菌株(D8107)中同源重組。BJ5183菌株表達recET基因,具有很高的基因同源重組(homologous recombination)活性,使帶有目的基因的穿梭質粒與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1通過末端反向重復序列同源重組,實現外源基因與腺病毒基因組的整合。將重組的攜帶外源基因的腺病毒質粒用Pac I線性化后轉染到AD-293、293A、HEK293等重組腺病毒包裝細胞中進行包裝。從而制備獲得高滴度、自我復制缺陷并且帶有目的基因的重組腺病毒。

目的基因引入時不能含有Pme I及Pac I這兩個酶切位點,如果含有該兩個酶切位點的目的基因,需要對該位點進行突變方可進行基因操作。

pShuttle-CMV-C-DsRed主要信息如下:

Feature Nucleotide Position
left inverted terminal repeat 1–103
encapsidation signal (ES) 183–331
CMV promoter 341–933
multiple cloning site 940–988
DsRed 993-1670
SV40 polyA 1690–1901
Ad5 right arm homology 1906–4160
Ad5 left arm homology 4208–5091
right inverted terminal repeat 4192–5194
pBR322 origin 5402–6069
kanamycin resistance ORF 6878–7669

pShuttle-CMV-C-DsRed 質粒(8155bp)的圖譜如下:

pShuttle-CMV-C-DsRed質粒的詳細圖譜見說明書:https://www.beyotime.com/Manual/D8115 pShuttle-CMV-C-DsRed.pdf。

pShuttle-CMV-C-DsRed 中沒有的酶切位點(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-C-DsRed)包括:

Acc65I Afl II Age I Asc I Asp718
Blp I BsiC I BsiW I BstB I Bsu36 I
Cla I Eco72 I EcoN I Esp I Fse I
Kpn I Nru I Pml I Pvu I Sfi I

pShuttle-CMV-C-DsRed 中的單酶切位點(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-C-DsRed once)包括:

SnaB I TAC|GTA 679 Sca I AGT|ACT 1683
Nhe I G`CTAG,C 940 Hpa I GTT|AAC 1800
Not I GC`GGCC,GC 945 BstX I CCAN,NNNN`NTGG 3017
BamH I G`GATC,C 952 Bst1107 I GTA|TAC 4173
Hind III A`AGCT,T 958 Xca I GTA|TAC 4173
EcoR V GAT|ATC 966 Pme I CTTT|AAAC 4194
Sal I G`TCGA,C 970 EcoR I G`AATT,C 4199
Mlu I A`CGCG,T 976 Avr II C`CTAG,G 4741
PaeR7 I C`TCGA,G 988 BspH I T`CATG,A 6137
Xho I C`TCGA,G 988 Psp1406 I AA`CG,TT 6536
Stu I AGG|CCT 1204 Rsr II CG`GWC,CG 7542
Xba I T`CTAG,A 1672 Xmn I GAANN |NNTTC 8143
Spe I A`CTAG,T 1678      

pShuttle-CMV-C-DsRed 質粒中推薦使用的測序引物序列如下:

forward primer (888-907): 5´GGTCTATATAAGCAGAGCTG3´

Reverse primer (1692-1714): 5´GTGGTATGGCTGATTATGATCAG 3´

pShuttle-CMV-C-DsRed的全序列信息:pShuttle-CMV-C-DsRed2.txt

 
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