pShuttle-CMV-C-DsRed (腺病毒質粒, 紅色熒光)是自行研發的用于構建表達C端DsRed(紅色熒光蛋白)融合蛋白的重組腺病毒包裝用的穿梭質粒。本穿梭質粒構建后,需要和預轉染了pAdEasy-1質粒的BJ5183菌株(D8107)以及重組腺病毒包裝細胞配合使用才能完成重組腺病毒的包裝。
pShuttle-CMV-C-DsRed質粒可以用于在包裝成腺病毒后表達C端含DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein,香菇珊瑚紅色熒光蛋白)標簽的融合蛋白。該質粒含有CMV啟動子,可以高效啟動目的蛋白在細胞中的表達。在多克隆位點的后面有一個DsRed的完整編碼序列,因此在多克隆位點根據閱讀框插入目的基因就可以表達C端含有DsRed標簽的融合蛋白。利用DsRed的熒光特性可以比較容易地觀察融合蛋白的表達水平和細胞內定位,也可以利用DsRed抗體來檢測或免疫沉淀融合蛋白。DsRed與GFP沒有序列同源性,不能使用GFP抗體檢測DsRed。
本質粒為卡那霉素抗性。
重組腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一種常見的用于在培養細胞或動物體內表達外源基因的重要工具。重組腺病毒具有感染宿主細胞范圍廣、感染不依賴細胞分裂、高滴度及目的基因表達水平高等特性。最常用的腺病毒載體是人類血清5型腺病毒。改造后的人類血清5型腺病毒,刪除了在病毒裝配過程中起關鍵作用的E1基因和非必須的能表達逃避宿主免疫的E3基因,E1和E3基因的刪除使得重組腺病毒不能自我復制,同時給外源基因的插入提供了空間,最長可插入7.5kb的外源基因。從而提高了重組腺病毒的的安全性和可操作性。再利用攜帶E1基因的AD-293、293A、HEK293等細胞作為包裝細胞就可以完成重組腺病毒的包裝。
pShuttle系列的穿梭質粒攜帶外源目的基因,經過Pme I線性化,隨后與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1(D8106)共轉化到大腸桿菌BJ5183中,或者轉化到已經預轉化了pAdEasy-1質粒的BJ5183菌株(D8107)中同源重組。BJ5183菌株表達recET基因,具有很高的基因同源重組(homologous recombination)活性,使帶有目的基因的穿梭質粒與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1通過末端反向重復序列同源重組,實現外源基因與腺病毒基因組的整合。將重組的攜帶外源基因的腺病毒質粒用Pac I線性化后轉染到AD-293、293A、HEK293等重組腺病毒包裝細胞中進行包裝。從而制備獲得高滴度、自我復制缺陷并且帶有目的基因的重組腺病毒。
目的基因引入時不能含有Pme I及Pac I這兩個酶切位點,如果含有該兩個酶切位點的目的基因,需要對該位點進行突變方可進行基因操作。
pShuttle-CMV-C-DsRed主要信息如下:
Feature Nucleotide | Position |
left inverted terminal repeat | 1–103 |
encapsidation signal (ES) | 183–331 |
CMV promoter | 341–933 |
multiple cloning site | 940–988 |
DsRed | 993-1670 |
SV40 polyA | 1690–1901 |
Ad5 right arm homology | 1906–4160 |
Ad5 left arm homology | 4208–5091 |
right inverted terminal repeat | 4192–5194 |
pBR322 origin | 5402–6069 |
kanamycin resistance ORF | 6878–7669 |
pShuttle-CMV-C-DsRed 質粒(8155bp)的圖譜如下:
pShuttle-CMV-C-DsRed質粒的詳細圖譜見說明書:https://www.beyotime.com/Manual/D8115 pShuttle-CMV-C-DsRed.pdf。
pShuttle-CMV-C-DsRed 中沒有的酶切位點(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-C-DsRed)包括:
Acc65I | Afl II | Age I | Asc I | Asp718 |
Blp I | BsiC I | BsiW I | BstB I | Bsu36 I |
Cla I | Eco72 I | EcoN I | Esp I | Fse I |
Kpn I | Nru I | Pml I | Pvu I | Sfi I |
pShuttle-CMV-C-DsRed 中的單酶切位點(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-C-DsRed once)包括:
SnaB I | TAC|GTA | 679 | Sca I | AGT|ACT | 1683 |
Nhe I | G`CTAG,C | 940 | Hpa I | GTT|AAC | 1800 |
Not I | GC`GGCC,GC | 945 | BstX I | CCAN,NNNN`NTGG | 3017 |
BamH I | G`GATC,C | 952 | Bst1107 I | GTA|TAC | 4173 |
Hind III | A`AGCT,T | 958 | Xca I | GTA|TAC | 4173 |
EcoR V | GAT|ATC | 966 | Pme I | CTTT|AAAC | 4194 |
Sal I | G`TCGA,C | 970 | EcoR I | G`AATT,C | 4199 |
Mlu I | A`CGCG,T | 976 | Avr II | C`CTAG,G | 4741 |
PaeR7 I | C`TCGA,G | 988 | BspH I | T`CATG,A | 6137 |
Xho I | C`TCGA,G | 988 | Psp1406 I | AA`CG,TT | 6536 |
Stu I | AGG|CCT | 1204 | Rsr II | CG`GWC,CG | 7542 |
Xba I | T`CTAG,A | 1672 | Xmn I | GAANN |NNTTC | 8143 |
Spe I | A`CTAG,T | 1678 |
pShuttle-CMV-C-DsRed 質粒中推薦使用的測序引物序列如下:
forward primer (888-907): 5´GGTCTATATAAGCAGAGCTG3´
Reverse primer (1692-1714): 5´GTGGTATGGCTGATTATGATCAG 3´
pShuttle-CMV-C-DsRed的全序列信息:pShuttle-CMV-C-DsRed2.txt