桿狀病毒穿梭載體bacmid小量抽提試劑盒(Baculovirus Shuttle Vector Bacmid Mini Preparation Kit, 簡稱Bacmid Miniprep Kit)是一種從大腸桿菌DH10Bac中簡單快速抽提高質量可完美應用于昆蟲細胞轉染的bacmid的試劑盒。

主要特點：簡單快速，不使用劇毒試劑，無須酚氯仿抽提，無須過柱純化，有效解決bacmid分子量大、抽提難度高等系列問題，確保抽提獲得的bacmid可完美用于昆蟲細胞轉染。
當目的基因被插入到pFastBac系列載體中構建成目的重組質粒后，該重組質粒可用于轉化大腸桿菌DH10Bac從而發生位點特異的轉座(site-specific transposition)，藍白斑篩選和PCR鑒定篩選含有重組bacmid的重組子，再使用本試劑盒進行bacmid的小量抽提即可獲得可轉染昆蟲細胞的bacmid DNA。
本試劑盒在抽提bacmid的同時，也會抽提輔助質粒(helper plasmid)和未重組的pFastBac質粒。抽提獲得的bacmid等質粒混合物可以直接用于轉染昆蟲細胞以包裝桿狀病毒，最終用于目的蛋白在昆蟲細胞中的大量表達。
Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統是由Luckow等人于1993年發展的一種快速而有效產生重組桿狀病毒的方法。該系統主要包括以下兩個組分：(1)用于插入目的基因的pFastBac載體，目的基因插入后受桿狀病毒特異性啟動子(baculovirus-specific promoter)調控表達；(2)含桿狀病毒穿梭載體bacmid (bMON14272, 136kb)和輔助質粒(helper plasmid，用于表達轉座必須的轉座蛋白)的大腸桿菌DH10Bac宿主菌株。將pfastBac重組質粒轉化該菌株可發生pfastBac重組質粒中mini-Tn7元件和bacmid上的mini-attTN7發生轉座，從而形成重組的bacmid。
利用Bac-to-Bac桿狀病毒感染昆蟲細胞產生重組蛋白主要包括以下實驗步驟：(1)把目的基因克隆到pFastBac載體產生重組質粒；(2)轉化pFastBac重組質粒到DH10Bac大腸桿菌感受態細胞產生重組bacmid；(3)利用桿狀病毒穿梭載體bacmid小量抽提試劑盒提取重組bacmid DNA；(4)將重組bacmid DNA轉染進入昆蟲細胞(推薦使用C0551 LipoInsect™轉染試劑)以產生重組桿狀病毒；(5)擴增重組的桿狀病毒并用其感染昆蟲細胞以大規模表達重組目的蛋白。
本試劑盒抽提獲得的高質量bacmid DNA可以直接用于轉染昆蟲細胞，LipoInsect™轉染試劑(C0551)適用于將pFastBac等桿狀病毒表達載體制備的bacmid轉染到Sf9、Sf21和High Five™等昆蟲細胞以用于Bac-to-Bac®、BaculoDirect™和InsectSelect™表達系統的蛋白表達。LipoInsect™轉染試劑的轉染效率非常高，對昆蟲細胞Sf9的實測陽性率可達98%以上。
關于昆蟲細胞系統的蛋白表達與純化的詳細介紹，
一個包裝的本產品可以進行50次bacmid的小量抽提。
包裝清單：

保存條件：
室溫保存，一年有效。
注意事項： 
第一次使用前把試劑盒提供的RNase A全部加入到溶液I (懸浮液)中，混勻，并在瓶上做好標記。加入RNase A后須4℃存放。
溫度較低時，溶液II和溶液III可能會有沉淀產生。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，37℃水浴加熱溶解，混勻后使用。
溶液II請勿過分劇烈混勻，否則會產生大量氣泡。
溶液II使用完后，請注意蓋緊瓶蓋，以避免被空氣中二氧化碳酸化。
本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行，但在4℃進行離心也是可以的。
溶液II有強堿性，溶液II和溶液III對人體都有刺激性，操作時請小心，并注意適當防護。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

​使用說明：
1. 取少量pFastBac重組質粒加入DH10Bac感受態，稍混勻后冰上靜置30分鐘，42℃熱激90秒，加入500μl SOC培養液培養4h。隨后涂板于已提前涂好X-gal (90mm瓊脂板涂40μl 2% X-gal)的含7μg/ml慶大霉素(gentamicin)、100μg/ml卡那霉素(kanamycin)、10μg/ml四環素(tetracycline)和40μg/ml IPTG的LB平板，37℃倒置培養過夜。
2. 培養48小時后挑取白斑至3ml SOC培養液(含7μg/ml慶大霉素、100μg/ml卡那霉素和10μg/ml四環素)中37℃ 200rpm培養過夜。
3. 取過夜菌1.5ml，10000g離心1分鐘收集細菌，棄上清。再加入1.5ml過夜菌，同前再次離心收集一次，每管共收集3ml過夜菌。
4. 加入300μl溶液I (已添加RNase A)，重懸細菌沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細菌團塊。
5. 加入300μl溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使細菌完全裂解，溶液透明。如果發現還沒有完全透明，可增加顛倒次數3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時間不要超過5分鐘。切勿vortex！
6. 加入300μl溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產生。>12000g離心10分鐘，吸取上清至一潔凈的2ml離心管中。如果上清中仍有少量不溶物，可以>12000g離心5-10分鐘，取出上清，確保上清澄清透明，無不溶物。
7. 于上清中緩慢加入已預冷的800μl異丙醇中，顛倒混勻，冰上放置10min，>12000g離心10分鐘后，棄上清。
8. 沉淀用500μl已預冷的70%乙醇重懸，>15000g離心5分鐘，棄上清。
9. 沉淀再次用200μl已預冷的70%乙醇重懸，>12000g離心5分鐘后，棄上清。
10. 沉淀室溫干燥，待乙醇揮發后，用20μl本試劑盒提供的TE溶解，-20℃保存。
11. 后續如有必要可以對抽提獲得的Bacmid進行PCR鑒定，以確定是否含有插入的目的片段。經測試按照上述步驟抽提獲得的Bacmid可以完美用于昆蟲細胞轉染試劑(如C0551 LipoInsect™轉染試劑)直接轉染昆蟲細胞。

常見問題：
1. 轉化DH10Bac感受態后平板上沒有藍斑，所有克隆均為白斑：
a. 藍白斑顯色時間不夠。需37℃培養至少48小時后才能鑒別。
b. 轉化后培養時間不夠。涂板前轉化菌需在SOC培養基中37℃培養至少4小時。
c. 平板配置時，忘記加入IPTG和X-gal了。平板須已提前涂好X-gal (90mm平板涂40μl 2% X-gal)并含7μg/ml慶大霉素、100μg/ml卡那霉素、10μg/ml四環素和40μg/ml IPTG。
d. 平板上克隆太多，太密。稀釋后涂板。
e. 平板配制時間過久或者存放于有光處。含有多種抗生素的平板超過4個星期通常就不能使用，且需避光保存。
2. 所有克隆都是藍色：
a. pFastBac1重組質粒質量不好或已降解。使用經過電泳檢查的高純度pFastBac1重組質粒。
b. 可能沒加慶大霉素。需嚴格按照相應方法來配制藍白斑篩選平板。
3. 克隆數量很少：
a. 轉化菌在SOC培養基中培養時間不夠。涂板前轉化菌需在SOC培養基中至少培養4小時。
b. 轉化DH10Bac感受態后使用的是LB培養基而不是SOC培養基。需使用SOC培養基至少37℃培養4小時或30℃培養6小時。
4. 藍白斑難以區分：
a. LB平板培養基配制的pH不對。可使用 LB Broth with Agar (premixed powder) (ST158)配制平板，并確保調節pH至7.0。
b. 37℃培養時間太短。涂板48小時后再進行觀察。
c. IPTG濃度不對。需要優化IPTG濃度，通常IPTG最佳濃度范圍為20-60μg/ml。
5. bacmid DNA發生了降解：
a. bacmid儲存不當。bacmid應在-20℃保存，并盡量避免反復凍融。
b. 提取大分子量的bacmid時，操作手法過于劇烈。抽提bacmid時，不要使用vortex，不能劇烈混合，操作須盡量溫和。