植物原生質(zhì)體分離試劑盒(Plant Protoplasts Isolation Kit)，是一種能夠簡單、快捷地通過酶學(xué)方法消化植物尤其是擬南芥(Arabidopsis thaliana)細(xì)胞壁中的纖維素并釋放出大量且具有生物活性的原生質(zhì)體的試劑盒。使用本試劑盒分離出的原生質(zhì)體可用于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染以及原生質(zhì)體融合等實(shí)驗(yàn)研究。
植物原生質(zhì)體是指去除掉細(xì)胞壁后由細(xì)胞膜包被的具有生命活力的植物細(xì)胞體。植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素(cellulose)，半纖維素(hemicellulose)和果膠(pectin)等。植物細(xì)胞壁組分被適當(dāng)?shù)拿赶到夂螅湍茚尫懦鰺o細(xì)胞壁包被的植物原生質(zhì)體。原生質(zhì)體是開展一系列植物細(xì)胞研究的重要材料，可以用于短時(shí)間基因表達(dá)(transient gene expression)、病毒感染(viral transfection)、體細(xì)胞雜交(somatic hybridization)、電生理研究(electrophysiological study)和形態(tài)學(xué)研究(morphological study)等，從而在植物亞細(xì)胞定位(subcellular localization)、蛋白活性分析以及蛋白與蛋白相互作用(protein-protein interaction)等研究方面發(fā)揮重要作用。
使用本試劑盒處理擬南芥葉片所獲得的原生質(zhì)體效果圖(圖1)：
圖1. 植物原生質(zhì)體分離試劑盒(Plant Protoplasts Isolation Kit)分離制備的擬南芥原生質(zhì)體效果圖。酶解體系配制(5ml)：稱取0.095g Enzyme Mix，加入2.5ml 2X Digest Buffer，55℃水浴10min使酶充分溶解，冷卻至室溫后，分別加入100μl Digest Solution I，10μl Digest Solution II和50μl Digest Solution III，加無菌水定容至5ml，輕輕混勻并溶解后，用0.45μm針頭濾器(FF365)過濾。生長狀態(tài)良好的擬南芥葉片20片，去除葉片的尖端與基部，用刀片(FS205)切成0.5-1mm小條，浸入細(xì)胞壁消化液中，真空干燥器抽真空30min，避光條件下消化3h后，輕輕搖動(dòng)并吸取少量消化液在光學(xué)顯微鏡下觀察游離的原生質(zhì)體(圖A)。消化比較充分后，將所得原生質(zhì)體溶液用1X Dilution Buffer進(jìn)行等體積稀釋，再用70μm孔徑的細(xì)胞過濾器(FSTR070)過濾所獲得的原生質(zhì)體溶液，以去除未消化完全的葉片，室溫下100g離心1min，去除上清，將其重懸于500μl Resuspension Buffer中，吸取100μl重懸的原生質(zhì)體，光學(xué)顯微鏡下觀察原生質(zhì)體的數(shù)量與形態(tài)(圖B)。實(shí)際的檢測效果會(huì)因檢測條件的不同而存在差異，本圖僅供參考。
按照每次使用5ml細(xì)胞壁酶消化體系計(jì)算，本試劑盒可用于20次細(xì)胞壁酶消化反應(yīng)。本試劑盒每個(gè)5ml反應(yīng)體系可處理0.1g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片)，操作較好的情況下每5ml體系可獲得約50-70萬個(gè)原生質(zhì)體(不同植物不同操作會(huì)有一定的差異)，可滿足約25-100個(gè)樣品的原生質(zhì)體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作(按照每樣1-2萬個(gè)細(xì)胞計(jì)算)。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C0362S-1 | 2X Digest Buffer | 50ml |
| C0362S-2 | Enzyme Mix | 2g |
| C0362S-3 | Digest Solution I | 2ml |
| C0362S-4 | Digest Solution II | 200μl |
| C0362S-5 | Digest Solution III | 1ml |
| C0362S-6 | 5X Dilution Buffer | 50ml |
| C0362S-7 | Resuspension Buffer | 50ml |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，至少一年有效。C0362S-2 Enzyme Mix可長期4℃保存，其余組分4℃存放數(shù)天不會(huì)影響使用效果。數(shù)天內(nèi)連續(xù)使用的情況，可以全部保存在4℃。
注意事項(xiàng)：
細(xì)胞壁消化液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，不能配制后凍存用于后續(xù)用途。
請按照試劑盒要求的保存條件存放相關(guān)試劑，使用時(shí)請將各溶液充分融解并混勻，盡量避免過多的反復(fù)凍融。
2X Digest Buffer (C0362S-1)以及Resuspension Buffer (C0362S-7)容易被微生物污染，使用時(shí)須嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)范進(jìn)行或者適當(dāng)分裝后使用。
所制備的原生質(zhì)體如果后續(xù)需要用于轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)等相對(duì)較長時(shí)間的用途，所有操作都必須按照無菌操作規(guī)范進(jìn)行。
需使用者自備的實(shí)驗(yàn)儀器與耗材：水浴鍋(E0530)，0.45μm針頭濾器(FF365)，手術(shù)刀片(FS205)，平頭鑷子(FS035)，70μm細(xì)胞過濾器(FSTR070)以及離心管等其它耗材。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.取如下條件生長的擬南芥葉片，或其它適當(dāng)?shù)闹参锶~片等組織。
將擬南芥種植于溫室營養(yǎng)土中，短日照(10-13h light at 23℃/11-14h dark at 20℃)，弱光(50-75μEm-2s-1)條件下培養(yǎng)，保持相對(duì)濕度為40-65%，大約3-4周后可進(jìn)行原生質(zhì)體制備。
2.原生質(zhì)體分離：
a.冰上解凍并混勻所需的各個(gè)組分，參考如下體系配制細(xì)胞壁消化液，并使用0.45μm針頭濾器(FF365)過濾除去不溶雜質(zhì)，溶解好的細(xì)胞壁消化液應(yīng)為澄清棕黃色溶液。55℃孵育可以有效滅活DNase和Protease，并促進(jìn)酶溶解。
| Reagent | Volume |
| 2X Digest Buffer | 2.5ml |
| Enzyme Mix | 0.095g |
| Incubate at 55℃ for 10min. Cool to room temperature, and add the following reagents. | |
| Digest Solution I | 100µl |
| Digest Solution II | 10µl |
| Digest Solution III | 50µl |
| Water (Sterile) | 2.34ml |
| Total | 5ml |
b.選取長勢較好的3-4周齡的擬南芥幼苗，取0.1g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片)，用刀片去除葉片的尖端與基部，或選擇適當(dāng)?shù)钠渌参锶~片等組織(宜盡量選擇柔嫩部位)，并將其切成0.5-1mm左右的小條，用平頭鑷子將切好的小條放入準(zhǔn)備好的細(xì)胞壁消化液中并使其完全浸入。
c.使用玻璃真空干燥器室溫避光條件下抽真空30min，以使細(xì)胞壁消化液更好地進(jìn)入細(xì)胞間隙。在室溫條件下，無需振搖，酶消化3h。細(xì)胞壁消化液在緩慢旋轉(zhuǎn)后變成綠色，表示已有原生質(zhì)體釋放。注意：酶消化的時(shí)間不同植物不同部位會(huì)有較大的差別，3h為對(duì)于擬南芥葉片的推薦時(shí)間，實(shí)際操作時(shí)可以根據(jù)原生質(zhì)體的釋放情況，酌情調(diào)整消化時(shí)間。真空泵使用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常用的用于吸除液體的真空泵即可，例如E0110、E0111、E0112、E0113、E0114或E0115真空泵。
d.顯微鏡下觀察和檢查原生質(zhì)體的釋放情況，擬南芥原生質(zhì)體大小約為30-50μm。無須等原生質(zhì)體完全釋放出來后再進(jìn)行后續(xù)操作的。如果消化時(shí)間過長，也會(huì)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。
e.取適量5X Dilution Buffer，用水稀釋至1X，用等體積的1X Dilution Buffer稀釋原生質(zhì)體，70μm細(xì)胞過濾器(FSTR070)或者75μm孔徑的尼龍篩網(wǎng)(約200目)過濾去除未消化的葉片組織。
f.收集濾液于50ml離心管，室溫100g離心1-2min，盡量去除上清，用5ml 1X Dilution Buffer重新懸浮原生質(zhì)體，室溫靜置30min。
g.原生質(zhì)體在重力作用下會(huì)在離心管底部沉降，盡量吸除上清，收集原生質(zhì)體(如果發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體沉降的速度比較慢或者得率比較低，也可以考慮室溫100g離心1-2min)，加入約1.5-2.5ml或更小體積的Resuspension Buffer，將原生質(zhì)體以2×105/ml的密度或更高密度懸浮于重懸液中，即為原生質(zhì)體懸液。制備好的原生質(zhì)體可以在4℃或冰浴保存至少24h。
常見問題：
1.原生質(zhì)體產(chǎn)量低及形態(tài)異常。
a.擬南芥的生長狀態(tài)對(duì)原生質(zhì)體的分離效率有非常大的影響。擬南芥種子的生長及保存條件、土壤養(yǎng)分、溫度、濕度、光照周期、光照強(qiáng)度等諸多因素均可能會(huì)影響植物的生長狀態(tài)，且不同的擬南芥株系生長條件略有差異，故盡量保證合適的擬南芥生長條件并選用形態(tài)及生長良好的葉片進(jìn)行原生質(zhì)體分離。
b.檢查細(xì)胞壁消化液的配制是否正確。
c.確保加入Enzyme Mix后在55℃孵育了10min。
d.根據(jù)不同植物以及突變體株系適當(dāng)調(diào)整酶消化的時(shí)間。
e.離心沉淀原生質(zhì)體時(shí)離心力過高或時(shí)間過長。
f.葉片的碎條需要和細(xì)胞壁酶消化液充分接觸。如果葉片的碎條沒有及時(shí)放入到細(xì)胞壁酶消化液中而出現(xiàn)了干燥的情況，后續(xù)就較難被細(xì)胞壁酶消化液充分浸潤，從而會(huì)嚴(yán)重影響原生質(zhì)體的得率。此外，抽真空，去除葉片碎條表面的微小氣泡，也是細(xì)胞壁酶消化液充分對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行消化的必要條件。
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