Mito-Tracker Red CMXRos (線粒體紅色熒光探針,可固定通透)，也稱MitoTracker Red CMXRos，是一種具有細胞通透性的X-rosamine衍生物(Chloromethyl-X-rosamine，簡稱CMXRos)，能夠特異性地標記細胞中具有生物活性的線粒體，檢測線粒體膜電位。本產品為高純度探針，兼容后續的細胞固定和通透，但染色后再固定和通透，熒光強度會有一定程度的下降。

本產品是一種氧化型的紅色熒光染料，只需簡單地和細胞孵育，即可通過被動運輸穿過細胞膜，并借助本探針含有的弱巰基反應性的氯甲基(mildly thiol-reactive chloromethyl)官能團特異性地標記有生物活性的線粒體。本探針含有的弱巰基反應性的氯甲基，可以和線粒體內蛋白的巰基反應并共價連接，因此后續實驗使用多聚甲醛或甲醛等醛類固定劑，以及細胞通透的去垢劑Triton X-100等處理時，線粒體的熒光標記不會消失，但可能會有一定程度的下降(約下降2-10倍)。由于本熒光探針的激發光譜和發射光譜與常見的綠色熒光探針重疊較少，因此非常適合用于熒光雙標實驗。

Mito-Tracker Red CMXRos分子式為C32H32Cl2N2O，分子量為531.5，CAS number為167095-09-2，Mito-Tracker Red CMXRos呈紅色熒光，最大激發波長為579nm，最大發射波長為599nm。Mito-Tracker Red CMXRos的激發光譜和發射光譜以及結構式參考圖1。

圖1.Mito-Tracker Red CMXRos的激發光譜和發射光譜(A)以及結構式(B)。

Mito-Tracker Red CMXRos可以用作線粒體特異性的熒光探針。和Rhodamine 123或JC-1相似，Mito-Tracker Red CMXRos對于線粒體的染色依賴于線粒體膜電位，因此該探針只能對活的細胞或組織進行染色，不能對固定或通透后的細胞或組織進行染色。使用Mito-Tracker Red CMXRos染色活細胞線粒體效果參考圖2。

圖2.Mito-Tracker Red CMXRos (可固定通透)染色NRK-52E細胞(大鼠腎小管上皮細胞)線粒體的效果。圖A為明場下大鼠腎小管上皮細胞形態圖；藍色熒光為Hoechst 33342染色(C1027/C1028/C1029 Hoechst 33342活細胞染色液(100X))大鼠腎小管上皮細胞的細胞核(圖B)，紅色熒光為Mito-Tracker Red CMXRos染色大鼠腎小管上皮細胞的線粒體(圖C)，圖D為Hoechst 33342和Mito-Tracker Red CMXRos雙染的大鼠腎小管上皮細胞的細胞核與線粒體。實測數據會因實驗條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數據僅供參考。

由于Mito-Tracker Red CMXRos在線粒體內的聚集依賴于線粒體的膜電位，因此本產品也可以作為線粒體膜電位的指示探針，通過檢測線粒體膜電位的變化來檢測細胞凋亡。

按最終工作濃度為50-200nM計算，本產品每50µg可以配制約500-2000ml Mito-Tracker Red CMXRos工作液。

包裝清單：

保存條件：

-20℃避光保存，一年有效。

注意事項：

Mito-Tracker Red CMXRos (可固定通透)可以用于活細胞的線粒體熒光染色，不適合用于固定后細胞或者組織的染色；但在用本產品標記線粒體后，后續可以進行固定和通透，并用其它探針進行染色或進行免疫熒光染色，但染色后再固定和通透，熒光強度會有一定的下降。而且不同的細胞，固定和通透的影響會有所區別，建議對固定和通透試劑、條件進行一定的測試。

本產品僅包含非常微量的粉末，使用前請先離心數秒鐘，使微量粉末充分沉降到管底。

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

使用本產品可以在常見的多孔板或培養皿中進行熒光染色，也可以在蓋玻片或載玻片上進行熒光染色。

本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.Mito-Tracker Red CMXRos儲存液的配制：
取一管50μg Mito-Tracker Red CMXRos粉末加入470μl的無水DMSO (anhydrous dimethylsulfoxide)，充分溶解后，得到濃度為200μM的Mito-Tracker Red CMXRos儲存液。也可以根據需要配制成其它濃度的儲存液，如1mM。適當分裝后避光保存于-20℃或更低溫度。
2.Mito-Tracker Red CMXRos工作液的配制：
a.取少量200μM Mito-Tracker Red CMXRos儲存液按照1:1000-1:10,000的比例加入到細胞培養液或適當的溶液(例如含鈣鎂離子的HBSS)中，使最終濃度為20nM-200nM。例如取1µl 200μM的Mito-Tracker Red CMXRos儲存液加入到1ml細胞培養液或適當的溶液(例如含鈣鎂離子的HBSS)中，混勻后即為200nM的Mito-Tracker Red CMXRos工作液。如果染色的細胞后續需要進行固定或通透等步驟，建議工作濃度為50nM-200nM。Hanks' Balanced Salt Solution (with Ca2+ & Mg2+) (C0219)可以向雅吉訂購。
b.Mito-Tracker Red CMXRos工作液使用前需37℃預溫育。
注：Mito-Tracker Red CMXRos工作液的濃度可以根據實際情況進行適當調整。為降低非特異性熒光染色和線粒體毒性，在染色效果可以接受的范圍內，建議盡量使用較低濃度的Mito-Tracker Red CMXRos。
3.貼壁細胞的線粒體染色：
a.當細胞在細胞培養板或培養皿中培養至一定密度時，去除細胞培養液，加入步驟2中配制好的Mito-Tracker Red CMXRos工作液，37℃孵育15-30分鐘。注：最佳孵育時間需根據細胞類型進行適當的優化。
b.去除Mito-Tracker Red CMXRos工作液，加入37℃預溫育的新鮮細胞培養液。
c.用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或熒光酶標儀進行觀察或檢測。此時可觀察到線粒體呈明亮的強熒光染色。如果染色效果欠佳，可以提高Mito-Tracker Red CMXRos工作液濃度或在推薦的時間范圍內適當延長染色時間。
注：標記的Mito-Tracker Red CMXRos易淬滅，請注意盡快進行拍照等熒光檢測。也可以通過降低熒光顯微鏡的激發光強度(即汞燈或LED光源)或適當降低Mito-Tracker Red CMXRos工作液濃度以延緩淬滅。
4.懸浮細胞的線粒體染色：
a.1000×g離心5分鐘，棄上清，用37℃預熱的Mito-Tracker Red CMXRos工作液輕輕重懸細胞，37℃孵育15-30分鐘。注：最佳孵育時間需根據細胞類型進行適當的優化。
b.孵育結束后，1000g離心5分鐘，棄上清，加入37℃預溫育的新鮮細胞培養液重懸細胞。
c.用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀或熒光酶標儀進行觀察、分析或檢測。
注：如果需要在載玻片或蓋玻片上固定懸浮細胞，可先用雅吉的Poly-D-lysine/多聚賴氨酸(ST508)處理載玻片或蓋玻片。
5.染色后的細胞固定或細胞通透(選做)：
用本試劑染色線粒體后，可進行固定和通透，并用其它探針再進行染色。
a.細胞固定：在染色后，用37℃溫育的新鮮細胞培養液或HBSS洗滌細胞，小心吸除洗滌用的培養液，加入4%多聚甲醛固定液(例如P0099)或含3.7%新鮮甲醛的完全培養液，室溫固定15-30分鐘。固定完成后用HBSS洗滌2-3次。
注：采用37℃預熱的固定液并在37℃固定約15min，可更好地維持細胞形態。對于內皮細胞，在本染料染色之后再用含3.7%甲醛的完全培養液于37℃孵育15分鐘有良好的固定效果。
b.細胞通透：將固定后的細胞加入含約0.2% Triton X-100的PBS或雅吉生產的免疫染色通透液(Triton X-100) (P0096)或免疫染色強力通透液(P0095)，室溫孵育10-15分鐘。然后用PBS洗滌。使用本探針染色活細胞后，再固定和通透的細胞內熒光效果參考圖3。
注1：對于內皮細胞，在本染料染色之后再用含約0.2% Triton X-100的PBS室溫孵育10分鐘有良好的通透效果。
注2：也可用丙酮冰浴通透5分鐘，然后用PBS洗滌。即使后續無需抗體標記，丙酮通透處理對降低背景信號也會有一定的幫助。
注3：染色后再固定和通透，熒光強度會有一定的下降，而且不同的細胞，固定和通透的影響會有所區別，建議對固定和通透試劑的濃度等進行一定的摸索。

圖3.Mito-Tracker Red CMXRos (可固定通透)染色NRK-52E細胞后再經固定和通透的細胞熒光染色效果。正常NRK-52E細胞Mito-Tracker Red CMXRos (可固定通透) 染色后線粒體內呈清晰明亮的紅色熒光(圖A)；染色后經4%多聚甲醛固定液(P0099)室溫固定15分后細胞內紅色熒光略有下降，熒光出現一定程度的彌散(圖B)；固定后經免疫染色強力通透液(P0095)通透后細胞內紅色熒光進一步下降(約下降2-10倍)，細胞內線粒體呈較弱的紅色熒光，但線粒體染色相對比較清晰(圖C)。注：由于通透后線粒體熒光有一定程度的下降，為了方面觀察，圖C延長了拍攝時的曝光時間。實測數據會因實驗條件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數據僅供參考。

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