YO-PRO-1/PI細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒(Apoptosis and Necrosis Detection Kit with YO-PRO-1and PI)，簡稱YP1/PI細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒，是一種基于DNA綠色熒光染料YO-PRO-1 (YP1)和紅色熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)的雙熒光法檢測細(xì)胞凋亡和壞死的試劑盒。本試劑盒適用于熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀及其它熒光檢測系統(tǒng)。

YO-PRO-1，又名惡唑黃(Oxazole yellow)，簡稱YP1，是一種對正常動物細(xì)胞膜沒有通透性而對于凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜有通透性的DNA綠色熒光染料，常用于細(xì)胞凋亡的檢測。YO-PRO-1是一種非細(xì)胞膜穿透性的并對DNA具有高親和力的羰花青單體綠色熒光染料，在沒有與DNA結(jié)合的時候基本上沒有熒光，而與DNA結(jié)合后可以發(fā)出明亮的綠色熒光。在細(xì)胞凋亡發(fā)生時，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，此時YO-PRO-1可以進入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，發(fā)出明亮的綠色熒光，因此常使用本熒光染料用于分析和鑒定凋亡細(xì)胞。需要注意的是YO-PRO-1也能染色壞死細(xì)胞，因此需要和對壞死細(xì)胞特異性熒光染色的PI進行雙染才能有效判定細(xì)胞凋亡。

PI，即碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種核酸紅色熒光染料，只能染色細(xì)胞膜完整性喪失的壞死細(xì)胞，并與核酸結(jié)合發(fā)出明亮的紅色熒光。因此， YO-PRO-1與碘化丙啶(PI)聯(lián)合使用，可以同時進行凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的檢測，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，壞死細(xì)胞同時呈現(xiàn)紅色和綠色熒光陽性，活細(xì)胞很少或幾乎沒有熒光。

細(xì)胞死亡包括凋亡(apoptosis)、壞死(necrosis)、焦亡(pyroptosis)等多種形式。其中受調(diào)控的細(xì)胞死亡被稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD)。程序性細(xì)胞死亡包括凋亡、細(xì)胞程序性壞死(programmed necrosis)或壞死性凋亡(necroptosis)和焦亡等。從細(xì)胞膜的完整性角度來看，凋亡的特征是細(xì)胞膜的完整性會保留，而壞死的特征是細(xì)胞膜的完整性會喪失。

細(xì)胞凋亡是生物體發(fā)育等生命過程中普遍存在的、由基因決定的細(xì)胞主動有序的死亡方式。當(dāng)細(xì)胞遇到內(nèi)、外環(huán)境因子刺激時，啟動基因調(diào)控的自殺保護措施，去除體內(nèi)非必需細(xì)胞或即將發(fā)生特化的細(xì)胞。在這一過程中，細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，并迅速被巨噬細(xì)胞或鄰近細(xì)胞清除，不會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，這是一種由基因控制、高度有序的細(xì)胞自主死亡，包含一系列信號事件組成的通路。細(xì)胞凋亡的主要特征包括細(xì)胞膜保持完整、細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻(Annexin V染色陽性)、基因組DNA片段化(DNA fragmentation) (即產(chǎn)生DNA ladder并且TUNEL染色陽性)、電鏡或熒光染色時細(xì)胞核碎裂或致密濃染、Caspase 3等激活、線粒體膜電位下降、細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放等。

壞死通常被認(rèn)為是一種偶發(fā)性的并且是被動的細(xì)胞死亡，如物理性或化學(xué)性的損害因素及缺氧與營養(yǎng)不良等都可以導(dǎo)致細(xì)胞壞死。壞死細(xì)胞初期細(xì)胞膜通透性增高，致使細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器變形或腫大，早期細(xì)胞核無明顯形態(tài)學(xué)變化，最后細(xì)胞破裂，細(xì)胞膜喪失完整性，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物，并常引起炎癥反應(yīng)，但不會出現(xiàn)細(xì)胞凋亡或自噬標(biāo)志物。通常，凋亡對生命體是有利的，而壞死很可能是有害甚至是致命的。凋亡的晚期也可以發(fā)生繼發(fā)性壞死(secondary necrosis)。受細(xì)胞程序性調(diào)控的壞死(programmed necrosis)被稱為necropotosis。

YO-PRO-1與DNA結(jié)合后的最大激發(fā)光波長為491nm，最大發(fā)射波長為509nm；PI與DNA結(jié)合后的最大激發(fā)光波長為535nm，最大發(fā)射光波長為617nm。YO-PRO-1、PI與DNA結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖1。

圖1. YO-PRO-1、PI與DNA結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

本試劑盒作為一種細(xì)胞凋亡和壞死檢測試劑盒，可以應(yīng)用于大多數(shù)的哺乳動物細(xì)胞，包括貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞，與傳統(tǒng)的Annexin V-FITC/PI檢測方法相比，檢測準(zhǔn)確性和靈敏度相當(dāng)。本試劑盒用于檢測細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的效果參考圖2。

圖2.YO-PRO-1/PI細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒檢測MOLM13 (人急性髓原白血病細(xì)胞)細(xì)胞凋亡與壞死的效果。正常狀態(tài)的MOLM13細(xì)胞在明場下的形態(tài)見圖A；正常細(xì)胞不會被YO-PRO-1以及PI染色(圖B-D)。50μM Camptothecin誘導(dǎo)7小時后的MOLM13細(xì)胞在明場下的形態(tài)見圖E；此時細(xì)胞產(chǎn)生明顯的凋亡，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被YO-PRO-1染色為綠色熒光(圖F)；壞死細(xì)胞的細(xì)胞核則同時被YO-PRO-1和PI染色，紅色熒光和綠色熒光重疊呈現(xiàn)橙黃色 (圖G)。實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器的不同而存在差異，本圖僅供參考。

本試劑盒提供的YO-PRO-1和PI為1000X溶液，使用非常便捷。為了得到比較理想的染色結(jié)果，請根據(jù)細(xì)胞類型和實驗實際情況對探針染色液的稀釋倍數(shù)進行適當(dāng)調(diào)整。YO-PRO-1的工作濃度一般為0.5-5X，推薦使用濃度為1X；PI的工作濃度為0.1-4X，推薦使用濃度為1X。同時，本試劑盒配套提供的檢測緩沖液可在一段時間內(nèi)維持細(xì)胞的正常狀態(tài)， 并給細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)，效果通常比PBS或HBSS更好。

本試劑盒小包裝C1075S和中包裝C1075M用于流式細(xì)胞儀，每個樣品使用0.5ml的檢測工作液，可以分別進行100次和500次檢測；用于96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時可以分別可以檢測500次和2500次，檢測體系體積為200μl時可以分別可以檢測250次和1250次。實際檢測次數(shù)會因為檢測體系的大小和所使用底物濃度的高低而有所不同。

包裝清單：

保存條件：

-20℃避光保存，至少1年有效。C1075-3檢測緩沖液也可4℃保存。

注意事項：

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

檢測緩沖液應(yīng)在無菌環(huán)境中使用，否則可能會被微生物污染而影響使用效果，甚至無法繼續(xù)使用。

兩種熒光探針首次使用時，可以適當(dāng)分裝后在-20℃避光保存，適當(dāng)避免反復(fù)凍融。

YP1和PI對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當(dāng)防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.YP1/PI檢測工作液準(zhǔn)備：
a.YP1/PI檢測工作液的用量：對于6、12、24、96孔板，每孔YP1/PI檢測工作液的用量分別為0.5~1ml、200~500μl、100~200μl和50~100μl；對于流式細(xì)胞樣品，每個樣品的YP1/PI檢測工作液的體積為0.5ml。
b.YP1/PI檢測工作液的配制：根據(jù)樣品數(shù)量和每個樣品所需工作液的體積，計算出YP1/PI檢測工作液的總體積。以流式細(xì)胞儀檢測為例，每個樣品的YP1/PI檢測工作液的體積為0.5ml，參考下表配制YP1/PI檢測工作液。

注1：本試劑盒中提供的檢測緩沖液在一段時間內(nèi)可以維持細(xì)胞的正常狀態(tài)，并給細(xì)胞提供一定的營養(yǎng)，效果通常比PBS或HBSS更好，也可以用其它合適的溶液，如無血清培養(yǎng)液代替。
注2：檢測工作液中的YP1和PI的最終濃度需根據(jù)不同細(xì)胞系和實驗體系通過預(yù)實驗進行優(yōu)化。
2.熒光顯微鏡檢測：
a.接種培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于96孔板等多孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿中或者細(xì)胞爬片上，按實驗設(shè)計對細(xì)胞進行一定處理。
b.洗滌(選做)。對于貼壁細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1次；對于懸浮細(xì)胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1次。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當(dāng)體積的YP1/PI檢測工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育5-20min。不同的細(xì)胞最佳孵育時間有所不同，以5min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實際染色效果對染色時間進行適當(dāng)調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結(jié)束后，在熒光顯微鏡下觀察熒光染色效果(YP1染色陽性細(xì)胞為綠色熒光，Ex/Em=491/509nm；PI染色陽性細(xì)胞為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。對于懸浮細(xì)胞MOLM13，本產(chǎn)品的熒光檢測效果參考圖2。如有需要，也可進一步進行其它熒光的復(fù)染，例如使用Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(C1027-C1029)染色細(xì)胞核等。注意整個過程均需注意避光操作。
3.流式細(xì)胞儀檢測：
a.細(xì)胞準(zhǔn)備。貼壁細(xì)胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸，并用PBS洗滌一次；懸浮細(xì)胞250-1000×g室溫離心5min，棄上清，用PBS洗滌一次。每個樣品推薦的細(xì)胞用量為106個細(xì)胞。
b.染色。對于上一步驟的106個細(xì)胞的沉淀，加入0.5ml YP1/PI檢測工作液，重懸為單細(xì)胞懸液。37℃避光孵育20min。注：需要準(zhǔn)備好僅含緩沖液的細(xì)胞樣品用作流式細(xì)胞儀檢測時的陰性對照，該緩沖液與配制YP1/PI檢測工作液的緩沖液宜保持一致。同時準(zhǔn)備兩管額外的細(xì)胞樣品，每管只加入一種染料(YP1或PI)，用于流式單染的補償調(diào)節(jié)。
c.檢測。孵育完成后，可以直接進行流式細(xì)胞儀檢測，也可以250-1000×g室溫離心5min沉淀細(xì)胞，吸凈液體后每個樣品加入1ml檢測緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(YP1染色陽性細(xì)胞為綠色熒光，Ex/Em=491/509nm；PI染色陽性細(xì)胞為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。如有需要，也可進行進一步的染色，例如使用Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(C1027-C1029)染色細(xì)胞核等。注意整個過程均需注意避光操作。染色后，將樣品置于冰上，并盡量在1小時內(nèi)進行流式細(xì)胞儀檢測和分析。
注1：使用僅含檢測緩沖液的并且未經(jīng)染色的細(xì)胞樣品用于流式細(xì)胞儀的陰性對照設(shè)置。
注2：細(xì)胞圈門(gate)時，注意不要圈入細(xì)胞碎片，并使用YP1或PI單染的細(xì)胞進行調(diào)節(jié)補償。雙染細(xì)胞流式檢測應(yīng)獲得兩個相對獨立的細(xì)胞群：綠色熒光的凋亡細(xì)胞群和紅色熒光陽性或者紅色熒光和綠色熒光雙陽性的壞死細(xì)胞群。壞死細(xì)胞的綠色熒光染色通常會比較弱一些。
注3：由于流式檢測比較靈敏，使用的熒光探針濃度可能要比熒光顯微鏡檢測時要低，此時可根據(jù)細(xì)胞類型和實際染色情況對YP1或PI的稀釋倍數(shù)進行適當(dāng)調(diào)整。
4.熒光酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞死活的變化：
a.接種培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于96孔板黑色多孔板中，如BeyoGold™全黑96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(FCP966)，每孔的細(xì)胞數(shù)需要控制在100-10,000個，通常宜在2000-5000個范圍內(nèi)。按實驗設(shè)計對細(xì)胞進行一定處理。
b.洗滌(選做)。對于貼壁細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1遍；對于懸浮細(xì)胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當(dāng)體積的YP1/PI檢測工作液，通常96孔板每孔加入100μl。37℃避光孵育5-20min。不同的細(xì)胞最佳孵育時間有所不同，以5min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實際染色效果對染色時間進行適當(dāng)調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結(jié)束后，用熒光酶標(biāo)儀檢測(YP1染色陽性細(xì)胞為綠色熒光，Ex/Em=491/509nm；PI染色陽性細(xì)胞為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。通過對比對照組兩種熒光探針的RFU (Relative fluorescence values)，可以得出凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系。​