總SOD活性檢測試劑盒(NBT法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一種基于NBT的顯色反應，通過比色來檢測細胞、組織或其它樣品中SOD即超氧化物歧化酶活性的試劑盒。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)能催化超氧化物陰離子發生歧化作用，生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內一種重要的抗氧化酶。
本試劑盒采用經典的氮藍四唑(NBT)顯色法。通過黃嘌呤(Xanthine)及黃嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XO)反應系統產生超氧陰離子(O2-.)，將氮藍四唑還原為藍色的甲臜(formazan)，后者在560nm處有強吸收。而SOD可清除超氧陰離子，從而抑制了甲臜的形成。反應液藍色愈深，說明超氧化物歧化酶活性愈低，反之則酶活性愈高。據此通過比色分析就可以計算出超氧化物歧化酶活性水平。本試劑盒的檢測原理圖如下:

     圖1. 基于黃嘌呤氧化酶偶聯反應體系和NBT的SOD酶活力檢測原理圖。XO：xanthine oxidase。本試劑盒的檢測不受樣品中過氧化氫的干擾。很多細胞和組織樣品中含有內源性的過氧化氫，會干擾SOD的檢測。本試劑盒通過添加適量過氧化氫酶等特殊方法，能有效去除常規樣品中過氧化氫的干擾。例如，對于SOD標準品的檢測，標準品中添加高達0.1mM的過氧化氫時，對于檢測結果仍無顯著影響。
本試劑盒可以檢測細胞或組織勻漿液上清、全血、紅細胞抽提物、血清等生物樣品中的SOD活性。一個試劑盒共可以進行100次檢測。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，半年有效。S0109-2 NBT需避光保存。
注意事項：
待測樣品-70℃可保存1個月。需注意反復凍融會導致SOD部分失活。
細胞或組織等樣品制備時不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液，否則會干擾本試劑盒的檢測。
抗氧化物會對本試劑盒的檢測產生干擾，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都會使測定出來的吸光度顯著升高。此時盡管樣品沒有顏色，如果設置了使用說明中的空白對照3，就可以消除樣品中的抗氧化物的干擾。
      本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 樣品的準備：
a. 細胞樣品的準備：收集細胞，用4℃或冰浴預冷的PBS或生理鹽水洗滌1-2遍。沉淀用預冷的PBS在4℃或冰浴進行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動勻漿器)。隨后勻漿液4℃離心，取上清作為待測樣品。
b. 組織樣品的準備：動物用生理鹽水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素鈉)灌流清除血液后獲取組織樣品。取適量的組織樣品，加入4℃或冰浴預冷的PBS在4℃或冰浴進行勻漿(可以使用玻璃勻漿器或各類常見電動勻漿器)。隨后勻漿液4℃離心，取上清作為待測樣品。
c. 血漿或紅細胞樣品的準備：用抗凝管收集血液，顛倒混勻。4℃ 600g離心10分鐘，移取上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可作為血漿樣本進行檢測。紅細胞樣品可以參考步驟1a細胞樣品的制備方法，或其它不含Triton X-100等去垢劑的樣品制備方法。
d.  上述樣品準備完畢后可以用生產的BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)測定蛋白濃度。通常10-20微克蛋白的細胞或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個活力單位左右(不同細胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)。每種樣品準備20-100微克蛋白量通常已經足夠用于后續檢測。
e. 根據蛋白濃度和預計的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當稀釋樣品。例如，小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為10%)上清，通常需要稀釋10-100倍。準備好的樣品如果當天測定，可以冰浴保存；如果當天不能完成測定，可以-70℃凍存，但建議盡量當天完成測定。
2. 試劑盒的準備工作：
a. NBT/酶工作液的配制：按照每個反應160μl的體積配置適量的NBT/酶工作液。均勻混合158μlSOD檢測緩沖液、1μl NBT和1μl酶溶液，即可配置成160μl NBT/酶工作液。根據待檢測樣品(包括標準品)的數量，配置適量的NBT/酶工作液。具體配置方法可以參考下表。配制好的NBT/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當天使用，但建議盡量現配現用。注意：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當混勻后再使用。

b.反應啟動工作液的配制：把試劑盒中的反應啟動液(40X)融解后混勻，按照每1μl反應啟動液(40X)加入39μl SOD檢測緩沖液的比例進行稀釋，混勻后即為反應啟動工作液。根據待檢測樣品(包括標準品)的數量，配置適量的反應啟動工作液。配制好的反應啟動工作液4℃或冰浴保存，可以在當天使用，但建議盡量現配現用。
c. (可選做)SOD標準品準備：需自備SOD標準品，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液將SOD標準品稀釋至如下系列濃度：200U/ml，100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml。在隨后的檢測中可以各取20微升，參考樣品進行檢測。說明：為避免稀釋后SOD酶活性的下降， SOD標準品宜現稀釋現使用；本試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標準品，但可以使用SOD標準品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考。
3. 樣品測定：
a. 參考下表使用96孔板設置樣品孔和各種空白對照孔。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液。加入反應啟動工作液后充分混勻。注意：加入反應啟動工作液后反應即會開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應啟動工作液的時間先后差異而導致的誤差。

*如果樣品有顏色或含有抗氧化物質，則需設置空白對照3；如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則沒有必要設置空白對照3。
b. 37℃孵育30分鐘。說明：孵育25至35分鐘檢測出來的SOD活力無顯著差異，但為保證檢測結果的一致性，推薦孵育30分鐘。
c. 在560nm測定吸光度，可以選擇設定600nm (或600nm以上，如650nm)作為參比波長(也稱參考波長)，560nm吸光度的讀數扣除參比波長的吸光度讀數即可作為實測讀數。
4. 樣品中總SOD活力的計算：
a. 抑制百分率的計算：
參考如下計算公式計算抑制百分率：
抑制百分率＝[(A空白對照1－A空白對照2)－(A樣品－A空白對照3)]/(A空白對照1－A空白對照2)×100%
如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物，則A空白對照2 = A空白對照3，此時可以把計算公式簡化為如下形式(簡化時可以不設置空白對照3)：
抑制百分率＝(A空白對照1－A樣品)/(A空白對照1－A空白對照2)×100%
如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測定。盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當稀釋樣品；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度較高的待測樣品。
b. SOD酶活力單位的定義：在上述黃嘌呤氧化酶偶聯反應體系中抑制百分率為50%時，反應體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(unit)。注意：SOD的活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據其定義的不同進行適當換算。
c. SOD酶活力的計算：

圖2. 本試劑盒對SOD標準品的檢測效果。圖A縱坐標ΔA560為孵育30分鐘后，空白對照1與SOD標準品孔的吸光度差值。SOD酶活力和ΔA560 (圖A)及抑制百分率(圖B)呈非線性關系，而1/SOD酶活力和1/抑制百分率成線性關系(圖C)。圖中數據僅作參考，實際測定獲得的標準曲線的斜率和截距可能會因具體反應條件的不同和上圖有較明顯的差別。

SOD酶活力的計算公式如下：
待測樣品中SOD酶活力單位＝檢測體系中SOD酶活力單位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units
例如，當抑制百分率為50%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；當抑制百分率為60%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。
d. 如果樣品為細胞或組織的勻漿液，可以根據樣品的蛋白濃度和稀釋倍數，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細胞抽提液，可以根據血紅蛋白含量，可換算為U/克血紅蛋白或U/毫克血紅蛋白。
附1：SOD酶活力計算的參考方案：可以先使用本試劑盒繪制SOD標準品的抑制百分率曲線，然后根據樣品檢測到的抑制百分率對比標準品的抑制百分率曲線計算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時不必使用本方案進行檢測和計算。此外，本方案需確保標準品的酶活力數據可靠，不會因為標準品的保存問題而導致實際酶活力下降。
附2：SOD酶活力的動力學檢測：如果條件許可，使用本試劑盒時也可以使用動力學方法檢測SOD的酶活力。通常在步驟3a后可以37℃孵育同時在560nm連續測定吸光度30分鐘。根據30分鐘內的吸光度變化的斜率計算出抑制百分率：
抑制百分率＝[(斜率空白對照1－斜率空白對照2)－(斜率樣品－斜率空白對照3)]/(斜率空白對照1－斜率空白對照2)×100%
其余的計算方法同上述非動力學的計算方法。動力學方法的檢測和計算更加精確一些，但檢測起來相對要麻煩一些。使用本試劑盒通常使用非動力學方法即可。

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