生產的支原體PCR檢測試劑盒(Mycoplasma PCR Detection Kit)，是一種通過巢式PCR法(Nested PCR)檢測培養細胞等生物材料中是否存在支原體污染的檢測試劑盒。

支原體(Mycoplasma)是最小、最簡單的原核生物。支原體有如下特征：支原體無細胞壁結構，所以針對細胞壁的許多常見的抗生素，如青霉素或β-內酰胺類抗生素對支原體無效；支原體大小介于細菌和病毒之間，約為0.2-0.8μm，所以部分支原體可通過0.22μm濾器，常規的過濾對支原體無效；很多支原體由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供營養，所以通常吸附或散落在細胞表面和細胞之間。支原體的這些特征使細胞培養過程中存在支原體污染的風險，細胞的支原體污染已經成為一個世界性的普遍問題。
支原體污染可能會嚴重影響細胞的狀態，使細胞的基因表達、代謝特征發生變化，導致細胞生長減緩、分化和死亡異常，嚴重影響細胞功能。這些影響因素會嚴重影響實驗結果的可靠性、可重復性和一致性，因此支原體污染的檢測非常重要。
細胞培養過程中的細菌、酵母或霉菌污染在光學顯微鏡下可見，但支原體污染在光學顯微鏡下通常不可見，必須通過特定的檢測方法進行檢測。檢測支原體污染的常用方法有支原體分離培養、ELISA、發光法等特殊的生化檢測以及DNA熒光染色檢測等。上述檢測方法中，大多操作步驟相對比較煩瑣、靈敏性不高、不能區分支原體種類、需要特殊儀器或所需時間較長。而PCR法操作相對比較簡單便捷，PCR擴增后通過電泳分析即可確定是否有支原體污染，并可根據擴增片段的大小大致預測至少11種所污染的支原體種屬。如果有必要，也可以對PCR產物進行常規測序以確定具體的支原體種屬。
本支原體PCR檢測試劑盒是利用兩對引物通過巢式PCR法特異性擴增支原體基因組DNA片段，從而實現對支原體的高靈敏度特異性檢測的。原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(space region)在各種生物種間的堿基序列差別很大，如16S和23S之間的間隔區。這個間隔區的DNA序列及長度在支原體各個種屬間既有非常保守的部分，也有較大差異的部分。在編碼16S和23S的保守區DNA上設計一對F1/R1引物，用于擴增16S和23S之間的間隔區，這就是巢式PCR的第一輪PCR (1st PCR)，用于初步鑒定是否有支原體污染；然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區的保守區上設計一條F2引物，在編碼23S rRNA的DNA上設計一條R2引物進行巢式PCR的第二輪PCR (2nd PCR)。通過巢式PCR可以大大提高檢測的特異性和靈敏度。本產品的檢測原理請參考圖1。

圖1. 支原體PCR檢測試劑盒的檢測原理圖。

本試劑盒可快速、有效、高靈敏度地檢測支原體污染。
本試劑盒提供了陽性對照Control template，便于確定PCR檢測是否能正常工作，及樣品中是否存在抑制PCR反應的物質。
如果發現有支原體污染，建議更換無污染的細胞進行培養。如果有必要預防或去除支原體，可以使用專用的支原體預防或去除試劑(C0288、C0290、C0292、C0293)。
如果用于20μl的PCR反應體系，本試劑盒共可以進行250次檢測。如果用于50μl的PCR反應體系，本試劑盒共可以進行100次檢測。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
由于PCR反應非常靈敏，可以擴增目的基因序列超過1000萬倍，在使用Taq酶時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。
一般情況，1st PCR可以初步鑒定是否有支原體污染，但建議進行2nd PCR以進一步確認。
本試劑盒不能檢測出人肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 實驗前的準備工作：
a. 需要用戶自己準備的器材
(a) PCR擴增儀。
(b) 瓊脂糖凝膠電泳裝置。
(c) 微量離心機。
(d) 無菌PCR管、離心管、槍頭及移液槍。
b. 試劑和檢測樣品準備
(a)雙蒸水或超純水。
(b)2X PCR Master Mix (D7228)、Easy-Load™ PCR Master Mix (2X) (D7251/D7255/D7259)或者其它Taq酶及PCR所需的dNTP等。
(c)瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液、DNA分子量標準、電泳染料。
(d)樣品：用于檢測支原體污染的樣品是細胞接種后培養了3-6天的培養上清液，或者是培養液、血清；如果使用細胞懸液做樣品，則需要提取DNA后再進行PCR。加入量一般為反應體系1/10的量或更少。
2. 1st PCR反應：
a. 融解并混勻PCR反應所需的各種溶液。將2X PCR Master Mix，例如Easy-Load™ PCR Master Mix (Green, 2X)置于冰浴上或冰盒內。參考下表在冰浴上設置PCR反應：

注：Control template的推薦用量為1μl。
b. PCR反應參數的設置可以參考如下示例：
STEP1 (起始變性): 94ºC 30sec
STEP2 (變性): 94ºC 30sec
STEP3 (退火): 55ºC 2min
STEP4 (延伸): 72ºC 1min
STEP5 (循環): Go To STEP2 for 30-35 cycles
STEP6 (最終延伸): 72ºC 5min
STEP7 (臨時保存): 4ºC forever
3. 2nd PCR反應：：
a. 參考下表在冰浴上設置PCR反應：

b.  PCR反應參數的設置可以參考如下示例：
STEP1 (起始變性): 94ºC 30sec
STEP2 (變性): 94ºC 30sec
STEP3 (退火): 55ºC 2min
STEP4 (延伸): 72ºC 1min
STEP5 (循環): Go To STEP2 for 30 cycles
STEP6 (最終延伸): 72ºC 5min
STEP7 (臨時保存): 4ºC forever
4. 擴增產物的電泳分析：
a.  反應結束后，取1st PCR及2nd PCR的反應產物各10μl，進行電泳確認擴增有無片段及片段大小。瓊脂糖凝膠電泳結果示意圖請參考圖2。如果實驗目的只是確定是否有支原體污染，1-2%的瓊脂糖凝膠電泳均可；如果需要確定片段大小并據此大致推測污染支原體的種類，優先推薦使用2%的瓊脂糖凝膠電泳。

圖2. 使用本支原體PCR檢測試劑盒進行PCR檢測時擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳示意圖。1、2、3是1st PCR產物；1#、2#、3#是相應的2nd PCR產物。各泳道的模板分別是：1和1#，Control template；2和2#，支原體污染的細胞上清；3和3#，超純水。M為DNA marker。

b.  以不同種屬的支原體為模板，1st PCR及2nd PCR的反應產物的條帶大小不同，具體擴增片段大小可參考下表。
本試劑盒確定可以擴增的支原體種類及1st PCR和2nd PCR擴增產物長度參考表：

注：本試劑盒主要用于檢測是否有支原體污染，但也可以通過1st PCR和2nd PCR擴增產物長度大致預測所污染的支原體種屬。如果有必要，也可以對PCR產物進行常規測序以確定具體的支原體種屬。
5. 關于陽性對照反應：
a. 一方面陽性對照Control template可以單獨使用，以確定PCR反應體系是否能正常工作。另一方面，陽性對照Control template也可以添加到樣品中，以確定樣品中是否含有抑制PCR反應的物質。Control template是人工合成的DNA片段，使用Control template時，1st PCR的反應產物是810bp，2nd PCR的反應產物是590bp。
b. 如果陽性對照Control template單獨使用時沒有獲得擴增片段，提示PCR檢測體系存在問題，需要考慮更換PCR反應相關試劑。
c. 如果陽性對照Control template單獨使用時獲得了預期的擴增片段，而陽性對照Control template添加到樣品一起進行PCR擴增反應時沒有獲得任何PCR擴增產物，提示PCR體系工作正常，但檢測樣品中存在抑制PCR反應的物質。此時建議將檢測樣品進行DNA抽提，再用提取的DNA作為模板進行擴增。也可以嘗試將樣品用超純水或PBS適當稀釋后再進行測試，此時如果樣品中支原體的污染程度比較高，基本上不會影響檢測，但如果樣品中支原體的污染程度比較低，很可能會導致檢測靈敏度顯著下降。
d. 如果陽性對照Control template單獨使用時獲得了預期的擴增片段，而陽性對照Control template添加到樣品一起進行PCR擴增反應時可能僅獲得支原體的PCR擴增產物或僅獲得陽性對照Control template的擴增產物，也可能同時獲得支原體和陽性對照Control template的擴增產物。其中一種模板量比較多時，通常更容易擴增獲得哪種模板的PCR擴增產物。其中一種模板特別多時，另外一種模板可能檢測不到明顯的擴增。