Calcein AM細胞活性檢測試劑盒(Calcein AM Cell Viability Assay Kit)是一種通過Calcein-AM熒光探針標記活細胞從而簡單、快速、靈敏、準確地用于細胞活性、細胞毒性或細胞增殖檢測的試劑盒。本試劑盒由于能用于活細胞的精確定量，也被稱為細胞熒光計數(shù)試劑盒(Cell Fluorescence Counting Kit)，簡稱Cell Fluorescence Counting Kit-F、CCK-F或CCKF。

本試劑盒檢測速度快，僅需約30分鐘即可完成細胞活性檢測。
本試劑盒檢測靈敏度高，線性范圍寬。本試劑盒可檢測低至50個活細胞，并且在50-50,000個細胞范圍內(nèi)有很好的線性關系。對于不同的細胞線性范圍略有差別。
本試劑盒通常推薦使用熒光酶標儀進行定量檢測，也可以使用流式細胞儀進行定量檢測。如果有必要，也可以使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡進行細胞的熒光檢測。
Calcein AM (Calcein Acetoxymethyl Ester，中文名稱為鈣黃綠素AM或鈣黃綠素乙酰氧基甲酯)，是一種可滲透進入細胞、常用于測定真核細胞活力或線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)的綠色熒光探針，近年來也被廣泛用于細胞活性、細胞毒性或細胞增殖的檢測。
Calcein AM是在Calcein (鈣黃綠素)的基礎上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基團，加強了疏水性，因此能夠很容易穿透活細胞膜，進入細胞內(nèi)，從而標記細胞。Calcein AM本身并無熒光，進入細胞后被細胞中內(nèi)源性酯酶水解生成具有強負電荷的不能通透細胞膜的極性分子鈣黃綠素(Calcein)，從而被滯留在細胞內(nèi)，而Calcein可發(fā)出強綠色熒光。與其它同類探針相比，由于Calcein AM的細胞毒性非常低，幾乎不會影響細胞功能如細胞增殖或淋巴細胞的趨化性等，而且對pH值敏感性低，所以Calcein AM是目前活細胞熒光染色的最理想探針之一。
由于死細胞缺乏酯酶，Calcein AM進入細胞后僅活細胞會被染色為綠色熒光，所以可對活細胞進行定量熒光檢測。本檢測方法無需任何放射性同位素標記(如[3H]-thymidine摻入法)或溶解步驟(如MTT檢測)，通常無須洗滌，即可獲得高度可重復性和精確性的細胞增殖檢測結果。本試劑盒用于活細胞數(shù)量熒光檢測的結果參考圖1。
圖1. Calcein AM細胞活性檢測試劑盒用于檢測MOLM13 (人急性髓原白血病細胞)活細胞數(shù)量的效果圖。MOLM13細胞經(jīng)計數(shù)后按3倍稀釋接種到BeyoGold™全黑96孔細胞培養(yǎng)板(FCP966)中，加入Calcein AM檢測工作液孵育30分鐘，隨后直接在熒光酶標儀下檢測Ex/Em=494/517nm。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
核酸紅色熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)由于不能穿透活細胞的細胞膜而只能染色細胞膜完整性被破壞的死細胞，所以Calcein AM常常與碘化丙啶(ST511)聯(lián)合使用，對活細胞和死細胞同時進行雙重熒光染色。本試劑盒中的Calcein AM (1000X)與碘化丙啶(需另購，ST511/ST512/ST1569)用于活細胞和死細胞雙染的結果參考圖2。
圖2. Calcein AM細胞活性檢測試劑盒與碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)聯(lián)合使用檢測L-929活細胞與死細胞的效果圖。L-929細胞在明場視野下可見明顯的壞死細胞(圖A)；綠色熒光標記的即為Calcein染色的活細胞(圖B)，紅色熒光標記的即為PI染色的死細胞(圖C)；Calcein和PI雙染merge后更可以觀察到活細胞和死細胞的差別(圖D)。在本實驗中，L-929細胞經(jīng)TSZ處理3小時。TSZ為TNFα、SM-164和Z-VAD-FMK組成的細胞程序性壞死誘導試劑盒(C1058)。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
本試劑盒可以應用于大多數(shù)的哺乳動物細胞。有報道稱Calcein AM也可以用于某些植物細胞如擬南芥(Arabidopsis)的根邊緣樣細胞(root border-like cells)及某些酵母如Pichia anomala和Saccharomyces cerevisiae。某些寄生蟲如Leishmania由于細胞膜組分的原因，Calcein AM不能進入活細胞，但卻可以進入凋亡早期的寄生蟲細胞，從而與PI聯(lián)用用于檢測凋亡早期的寄生蟲。由于真菌和細菌有細胞壁，會阻礙Calcein進入細胞，因此Calcein AM不適合用于真菌和細菌。
Calcein本身是一種金屬絡合指示劑，在生理pH條件下和Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe3+和Mn2+等金屬離子絡合時，熒光信號會發(fā)生淬滅。使用本試劑盒的時候需要避免在細胞培養(yǎng)液中額外添加這些影響Calcein熒光的物質(zhì)。Calcein AM及其水解產(chǎn)物Calcein的分子結構式參考圖3。
圖3. Calcein AM及其水解產(chǎn)物Calcein的分子結構式。
Calcein AM的水解產(chǎn)物Calcein的最大激發(fā)光波長為494nm，最大發(fā)射波長為517nm。Calcein的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖4。
圖4. Calcein的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。
本試劑盒提供的Calcein AM為1000X溶液。該1000X的Calcein AM溶液經(jīng)過優(yōu)化，對大多數(shù)細胞都適用，但為得到比較理想的結果，也可根據(jù)細胞類型和實驗實際情況對Calcein AM在500-2000稀釋倍數(shù)之間進行適當調(diào)整。本試劑盒同時提供適合Calcein AM染色的檢測緩沖液，該染色液可在一段時間內(nèi)維持細胞的正常狀態(tài)，并給細胞提供一定的營養(yǎng)，效果比PBS或HBSS更好。
各種細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒的比較和選擇
對于96孔板，按1:1000配制Calcein AM檢測工作液，且每孔使用100μl Calcein AM檢測工作液，此時本試劑盒C2013S可進行100次檢測，C2013M可進行500次檢測，C2013L可進行2500次檢測。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。Calcein AM (1000X)需要避光保存。
注意事項：
如果后續(xù)使用熒光酶標儀進行熒光定量檢測，細胞須接種于黑色多孔板，如BeyoGold™全黑96孔細胞培養(yǎng)板(FCP966)中。
熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
Calcein AM (1000X)在潮濕環(huán)境中容易分解，收到產(chǎn)品后建議適當分裝并-20℃密封保存。
由于Calcein AM在水溶液中不穩(wěn)定，Calcein AM檢測工作液須現(xiàn)配現(xiàn)用，不能配制后凍存。
培養(yǎng)液中的血清和酚紅對Calcein AM的染色可能有一定的影響，使熒光背景增強，建議在加入Calcein AM檢測工作液前適當洗滌細胞。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.Calcein AM檢測工作液的配制：
按照96孔板每孔100μl Calcein AM檢測工作液的體系，參考下表配制適量的Calcein AM檢測工作液，需充分混勻。

注1：為得到比較理想的結果，可根據(jù)細胞類型和實際情況對Calcein AM (1000X)在500-2000稀釋倍數(shù)之間進行適當調(diào)整。
注2：配制好的Calcein AM檢測工作液必須一次使用完畢，不能凍存。
注3：也可以用其它合適的緩沖液，如無血清培養(yǎng)液、HBSS (C0218)或PBS (C0221A/C0221D)稀釋Calcein AM (1000X)。本試劑盒配套提供的檢測緩沖液可在一段時間內(nèi)維持細胞的正常狀態(tài)，并給細胞提供一定的營養(yǎng)，效果通常比PBS或HBSS更好。
2.貼壁細胞的熒光酶標儀檢測或熒光顯微鏡檢測：
a.接種培養(yǎng)。將細胞接種于96孔板等多孔板、細胞培養(yǎng)皿中或者細胞爬片上，按實驗設計對細胞進行一定處理。如果用于96孔熒光酶標儀檢測，細胞須接種于黑色多孔板，如BeyoGold™全黑96孔細胞培養(yǎng)板(FCP966)中，每孔的細胞數(shù)需要控制在100-10000個，通常宜在2000-5000個范圍內(nèi)。
b.洗滌(選做)。吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞1遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾，吸除培養(yǎng)液和PBS時最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當體積的Calcein AM檢測工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。不同的細胞最佳孵育時間有所不同，以30min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實際染色效果對染色時間進行適當調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結束后，可以直接用熒光酶標儀(激發(fā)波長494nm，發(fā)射波長517nm，490nm和520nm也可以)檢測熒光并計算細胞活性，細胞活性和熒光強度成正比。根據(jù)具體的實驗目的，也可以在熒光顯微鏡下觀察染色效果。對于貼壁細胞L-929，本產(chǎn)品與PI聯(lián)合使用的效果參考圖2。如有需要，也可進一步進行其它熒光的復染。例如使用Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或Propidium Iodide/碘化丙啶(ST511)檢測細胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細胞核等。注意整個過程均需避光操作。
3.懸浮細胞的熒光酶標儀檢測或熒光顯微鏡檢測：
a.接種培養(yǎng)。將細胞接種于96孔板等多孔板、細胞培養(yǎng)皿中，按實驗設計對細胞進行一定處理。如果用于96孔熒光酶標儀檢測，細胞須接種于黑色多孔板，如BeyoGold™全黑96孔細胞培養(yǎng)板(FCP966)中，每孔的細胞數(shù)需要控制在100-10000個，通常宜在2000-5000個范圍內(nèi)。
b.洗滌(選做)。250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1-2遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾，吸除培養(yǎng)液和PBS時最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當體積的Calcein AM檢測工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。不同的細胞最佳孵育時間有所不同，以30min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實際染色效果對染色時間進行適當調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結束后，可以直接用熒光酶標儀(激發(fā)波長494nm，發(fā)射波長517nm，490nm和520nm也可以)檢測熒光并計算細胞活性，細胞活性和熒光強度成正比。根據(jù)具體的實驗目的，也可以在熒光顯微鏡下觀察染色效果。對于懸浮細胞MOLM13，本產(chǎn)品未經(jīng)洗滌直接使用熒光酶標儀檢測不同細胞數(shù)的效果參考圖1。
4.流式細胞儀檢測：
a.細胞準備。貼壁細胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸，并用PBS洗滌一次。懸浮細胞250-1000×g室溫離心5min，棄上清，用PBS洗滌一次。每個樣品推薦的細胞用量為106。
b.染色。對于上一步驟的106個細胞的沉淀，加入1ml Calcein AM檢測工作液，重懸為單細胞懸液。37℃避光孵育30min。注：需要準備好僅含緩沖液的細胞樣品用作流式細胞儀檢測時的陰性對照，該緩沖液與配制Calcein AM檢測工作液的緩沖液宜保持一致。
c.檢測。孵育完成后，可以直接進行流式細胞儀檢測，也可以250-1000×g室溫離心5min沉淀細胞，吸凈液體后每個樣品加入0.5ml緩沖液重懸細胞后用流式細胞儀檢測。如有需要，也可進行進一步染色。例如使用Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或Propidium Iodide/碘化丙啶(ST511)檢測細胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細胞核等。注意整個過程均需避光操作。染色后，將樣品置于冰上，盡量在1小時內(nèi)進行流式細胞儀檢測和分析。注意使用僅含檢測緩沖液的并且未經(jīng)染色的細胞樣品用于流式細胞儀的陰性對照設置。

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