T4 RNA Ligase 2, truncated (T4 Rnl2, truncated或Rnl2 (1-249))，即T4 RNA連接酶2截短型，該酶僅包含T4 RNA連接酶2 N端249個(gè)氨基酸，可特異性地將5’端預(yù)腺苷酰化的DNA或RNA (App-DNA或App-RNA)連接到RNA的3’羥基。
T4 RNA Ligase 2, truncated與T4 RNA Ligase 2的酶活性完全不同，后者是一種ATP依賴的dsRNA ligase，而前者是一種不依賴于ATP的，依賴于5’端預(yù)腺苷酰化的單鏈核酸連接酶。
T4 RNA Ligase 2, truncated常用于microRNA (miRNA)等3’端為羥基的單鏈RNA在克隆、高通量測(cè)序建庫(kù)或PCR檢測(cè)等時(shí)，在3’羥基端添加5’端預(yù)腺苷酰化的DNA或RNA接頭。
T4 RNA Ligase 2, truncated只能利用5’端預(yù)腺苷酰化的單鏈DNA或RNA作為3’端接頭，因此可以大大降低連接反應(yīng)的背景，通常是小RNA等建庫(kù)時(shí)的優(yōu)先選擇。
T4 RNA Ligase 2, truncated連接時(shí)不需要ATP，但需要5’端預(yù)腺苷酰化(也稱預(yù)腺苷化、腺苷酰化或腺苷化)底物。即使在有ATP存在的情況下，T4 RNA Ligase 2, truncated也不能催化連接單鏈DNA或RNA 5'-P末端與3'-OH末端之間形成磷酸二酯鍵。而T4 RNA Ligase 1可以在ATP存在的情況下，催化連接單鏈DNA或RNA 5'-P末端與3'-OH末端之間形成磷酸二酯鍵。因此T4 RNA Ligase 2, truncated特別適用于small RNA library的制備，不管是進(jìn)行miRNA的測(cè)序還是進(jìn)行directional mRNA-Seq，該酶都可以提高建庫(kù)的質(zhì)量，并有效降低連接反應(yīng)的背景。
T4 RNA Ligase 2, truncated催化連接AppDNA和ssRNA的效果請(qǐng)參見(jiàn)圖1。
圖1. T4 RNA Ligase 2, truncated和N公司的同類產(chǎn)品(Competitor T4 RNA Ligase 2, truncated)催化連接AppDNA和ssRNA的效果圖。使用本產(chǎn)品或國(guó)外N公司的T4 RNA Ligase 2, truncated，即T4 Rnl2(1-249)，在20µl反應(yīng)體系中加入圖中指定量的本產(chǎn)品或國(guó)外N公司的T4 Rnl2, truncated，25℃孵育60 min進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)完畢后立即取樣在65℃孵育20 min終止反應(yīng)，加入變性上樣緩沖液，在95℃孵育5 min后放至冰浴中，隨后用15%尿素(7M)變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分析，最終進(jìn)行核酸染色和熒光成像分析。如圖所示，本產(chǎn)品與N公司的產(chǎn)品相比，具有類似的催化效果。
用途：5’末端預(yù)腺苷酰化的單鏈DNA或者RNA與單鏈RNA的3’羥基末端連接；cDNA文庫(kù)構(gòu)建中連接5’末端預(yù)腺苷酰化單鏈寡核苷酸和小RNA；鏈特異性的cDNA文庫(kù)(strand-specific cDNA library)構(gòu)建中連接5’末端預(yù)腺苷酰化單鏈寡核苷酸和RNA；二代測(cè)序中，miRNA文庫(kù)構(gòu)建中RNA的3’末端與接頭之間的連接；cDNA文庫(kù)的構(gòu)建以進(jìn)行小RNA轉(zhuǎn)錄組分析(small-RNA transcriptome analysis)。
來(lái)源：大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白，表達(dá)基因?yàn)門4嗜菌體T4 RNA ligase 2 N端1-249位的氨基酸。
活性單位定義:200 units is defined as the amount of enzyme required to give 80% ligation of a 31-mer RNA to the pre-adenylated end of a 17-mer DNA (Universal miRNA Cloning Linker, Beyotime, Cat. No. R0702) in a total reaction volume of 10 µl in 1 hour at 25℃.
純度：無(wú)DNA內(nèi)切酶和外切酶活性，無(wú)RNA酶活性，無(wú)蛋白酶活性。
酶儲(chǔ)存溶液：10 mM Tris-HCl (pH7.5), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 50% (v/v) Glycerol.
失活或抑制：65℃加熱20 min可使T4 RNA Ligase 2, truncated失活，或加入蛋白酶K或EDTA也可以抑制其活性。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| R0635S-1 | T4 RNA Ligase 2, truncated (200U/µl) | 25µl |
| R0635S-2 | 10X T4 Rnl2, truncated Buffer | 75µl |
| R0635S-3 | PEG8000 (50%, RNase free) | 400µl |
| — | 說(shuō)明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| R0635M-1 | T4 RNA Ligase 2, truncated (200U/µl) | 100µl |
| R0635M-2 | 10X T4 Rnl2, truncated Buffer | 300µl |
| R0635M-3 | PEG8000 (50%, RNase free) | 1.5ml |
| — | 說(shuō)明書 | 1份 |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| R0635L-1 | T4 RNA Ligase 2, truncated (200U/µl) | 500µl |
| R0635L-2 | 10X T4 Rnl2, truncated Buffer | 1.5ml |
| R0635L-3 | PEG8000 (50%, RNase free) | 7.5ml |
| — | 說(shuō)明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，至少一年有效。
注意事項(xiàng)：
本產(chǎn)品提供的試劑均用不含DNA酶和RNA酶的水配制，可直接用于3’端為羥基的單鏈RNA和5’端腺苷酰化的DNA或RNA之間的連接反應(yīng)。
可根據(jù)具體應(yīng)用選擇合適的操作方法，可能需準(zhǔn)備額外的試劑，R0102 RNase inhibitor、R0022 DEPC水等。
使用本產(chǎn)品連接ssRNA和AppDNA時(shí)，建議使用的PEG8000的濃度為10%-30%，適當(dāng)提高PEG8000的濃度，會(huì)顯著提高T4 Rnl2, truncated的催化的連接效率，而不改變其反應(yīng)特性。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
1.用于連接5’端腺苷酰化并且3’端不是羥基的(例如為氨基)單鏈DNA (AppDNA-NH2)和3’端為羥基的單鏈RNA (ssRNA)的使用說(shuō)明具體如下。需要提前準(zhǔn)備好待連接的樣品，以及Universal miRNA Cloning Linker (R0702, Beyotime)或自備的適當(dāng)接頭。
2.參考下表在冰浴中配制如下反應(yīng)體系：
| Reagent | Volume | Final Concentration |
| ssRNA | xµl | 0.5 or 1µM |
| DEPC-treated Water | (4-x-y)µl | - |
| Universal miRNA Cloning Linker (R0702, Beyotime) | yµl | 1 or 0.5, or 2 or 1µM |
| PEG8000 (50%, RNase Free) | 12µl | 0.3 |
| 10X T4 Rnl2, truncated Buffer | 2µl | 1 X |
| RNase Inhibitor (40U/μl) | 1µl | 2U/μl |
| T4 RNA Ligase2, truncated (200U/µl) | 1µl | 10U/µl |
| Total Volume | 20µl | - |
注意：
a.由于涉及RNA操作，需要嚴(yán)格按照RNA操作的規(guī)范進(jìn)行，避免RNase污染，相關(guān)試劑和耗材需要經(jīng)過(guò)DEPC處理去除RNase或者確保是RNase free的。推薦在連接體系中添加RNase Inhibitor，以避免ssRNA或其連接產(chǎn)物的降解，盡管經(jīng)測(cè)試我們發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)格操作的情況下，不加RNase Inhibitor也不會(huì)導(dǎo)致ssRNA或其連接產(chǎn)物發(fā)生明顯降解。
b.進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，如果樣品RNA比較珍貴，希望充分被連接，可以按照接頭和樣品RNA的摩爾比為2:1的比例進(jìn)行連接；如果樣品RNA比較充裕，同時(shí)感覺(jué)接頭的成本偏高時(shí)，可以按照接頭和樣品RNA的摩爾比摩爾比1:1甚至1:2的比例進(jìn)行連接反應(yīng)，這樣可以很好地節(jié)省接頭。ssRNA的用量可以根據(jù)實(shí)際的樣品量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，相應(yīng)的接頭的用量也按照比例進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整即可。
c.如果同時(shí)進(jìn)行多個(gè)連接反應(yīng)，可以把上表中除ssRNA之外的所有溶液和酶提前預(yù)混合，然后再分裝到各反應(yīng)管內(nèi)。
3.連接反應(yīng)：25℃, 孵育60min。為了使連接反應(yīng)更加充分，可以適當(dāng)延長(zhǎng)連接反應(yīng)時(shí)間。
4. 終止反應(yīng)：65℃，孵育20min。
