5'DNA Adenylation Kit，即5’DNA腺苷酰化試劑盒，是一種非常便捷和高效的通過酶學方法將單鏈DNA (ssDNA) 5’端腺苷酰化修飾的試劑盒。
本試劑盒制備產生的5’端腺苷酰化修飾的單鏈DNA，常用于miRNA等3’端為羥基的RNA或3’端為羥基的單鏈DNA在克隆、高通量測序建庫或PCR檢測等時，在3’端添加的接頭。
本試劑盒進行腺苷酰化修飾反應時，需要腺苷酰化酶(Adenylase)、ATP和待腺苷酰化修飾的5’端磷酸化的單鏈DNA。
本試劑盒腺苷酰化修飾效率高，通常可以達到95%以上。對5’端磷酸化的單鏈DNA進行腺苷酰化修飾反應時，無論該單鏈DNA的3’端是否進行了氨基化等封閉都可以得到高產量的腺苷酰化產物。通常本試劑盒能將95%以上的5’端磷酸化的DNA (pDNA)轉化成腺苷酰化DNA (AppDNA)，因此腺苷酰化的產物通常不需要進行電泳切膠回收，可以直接通常乙醇沉淀進行進一步濃縮后用于后續的連接反應。
本產品以5’端磷酸化的單鏈DNA為底物，腺苷酰化酶將ATP分解成AMP和PPi，AMP轉移到單鏈DNA的5’磷酸基團上，形成腺苷酰化單鏈DNA，從而制備出腺苷酰化接頭(linker)。
本試劑盒催化5’端磷酸化單鏈DNA生成5’端腺苷酰化修飾單鏈DNA的效果參見圖1。
圖1. 使用5’ DNA Adenylation Kit制備5’端腺苷酰化修飾單鏈DNA的效果圖。反應體系為20μl，單鏈DNA的終濃度為5μM，反應條件為65ºC分別孵育15、30、45、60和90min，反應完畢后85℃孵育5min終止反應。電泳上樣前95℃孵育5min隨后置于冰浴以充分變性，尿素(7M)變性聚丙烯酰胺凝膠(15%)進行凝膠電泳分析。如圖所示，本試劑盒在15min內就可以將大部分5’端磷酸化單鏈DNA (pDNA)催化生成腺苷酰化的單鏈DNA (AppDNA)，孵育60min可以確保將95%以上的底物轉化成腺苷酰化修飾的單鏈DNA。
本產品也可以用于5’端磷酸化的單鏈RNA的5’端腺苷酰化修飾，可根據具體應用選擇合適的實驗步驟，同時需要額外準備R0102 RNase Inhibitor和R0021 DEPC水等。
本產品包含的Adenylase來源為嗜熱古細菌，在大腸桿菌中進行表達而獲得。
優點：單步反應即可完成5’端磷酸化修飾的單鏈DNA或RNA的腺苷酰化修飾，與傳統的化學方法相比較，更加簡便；對于底物轉化效率高達95%以上，無需切膠純化僅需酒精沉淀等即可用于后續反應；在65℃這樣一個較高的溫度反應，可以有效避免二級結構對于5’端腺苷酰化修飾反應的干擾；適用于pmol級別底物量的反應體系，也可以很方便地放大至µmol級別底物量的反應體系。
包裝清單：
| 產品編號 | 產品名稱 | 包裝 |
| R0716S-1 | Adenylase | 20µl |
| R0716S-2 | 10X Adenylation Reaction Buffer | 25µl |
| R0716S-3 | ATP (1mM) | 25µl |
| — | 說明書 | 1份 |
| 產品編號 | 產品名稱 | 包裝 |
| R0716M-1 | Adenylase | 100µl |
| R0716M-2 | 10X Adenylation Reaction Buffer | 125µl |
| R0716M-3 | ATP (1mM) | 125µl |
| — | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，至少一年有效。
注意事項：
底物單鏈DNA或單鏈RNA的5’端磷酸化是必須的，3’端可以進行氨基化等封閉，也可以不封閉。
本試劑盒提供的腺苷酰化反應體系可以按比例放大反應體系，對腺苷酰化產物的得率無顯著影響。
本試劑盒提供的Adenylase的最佳反應溫度為65℃，并且在25℃時會出現去腺苷酰化現象，因此反應完成后推薦在85℃孵育5min以失活Adenylase。如果沒有失活Adenylase，后續經歷室溫溫度條件時，會導致腺苷酰化比率下降。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
磷酸化的ssDNA序列 5’端腺苷酰化：
1.解凍5’端腺苷酰化修飾反應所需的各種試劑，將Adenylase置于冰浴上或冰盒內。
2.參考下表在冰浴中配制如下反應體系：
| Reagent | Volume | Final Concentration |
| Water (DNase free or DEPC-treated) | 13µl | - |
| ssDNA or ssRNA (100µM) | 1µl | 5µM |
| 10X Adenylation Reaction Buffer | 2µl | 1X |
| ATP (1mM) | 2µl | 0.1mM |
| Adenylase | 2µl | - |
| Total Volume | 20µl | - |
注意：
a.如果同時進行多個連接反應，可以把上表中除Nicked dsRNA Substrate之外的所有溶液和酶提前預混合，然后再分裝到各反應管內。
b.如果涉及RNA操作，需要嚴格按照RNA操作的規范進行，避免RNase污染，相關試劑和耗材需要經過DECP處理去除RNase或者確保是RNase free的。如果涉及單鏈RNA，推薦適量添加R0102 RNase Inhibitor。
3.腺苷酰化反應：65℃孵育1h。個別情況為了使連接反應更加充分，可以適當延長反應時間。
4.終止反應：85℃孵育5min。
5.腺苷酰化產物的電泳鑒定：電泳上樣前95℃孵育5min隨后置于冰浴，以充分變性。尿素(7M)變性聚丙烯酰胺凝膠(15%)進行凝膠電泳分析。腺苷酰化修飾后分子量會變大一點(參考圖1)。
6.濃縮及后續用途：可以采用常規的乙醇沉淀方法進行濃縮，后續可以使用T4 RNA Ligase2, truncated (200U/µl)等用于和小RNA等的3’羥基的連接反應。
常見問題：
1.腺苷酰化反應不完全或反應產物非常少。
a.用于制備腺苷酰化接頭時出現反應不完全的情況，建議可適當延長反應時間至2h甚至過夜。
b.在不改變底物量的前提下適當增加酶量，或在不改變酶量的前提下適當減少底物量。
c.當底物為ssRNA時，可能會出現ssRNA降解的情況，建議使用RNase Free的水及耗材。
d.電泳條帶不清晰或彌散，建議用尿素(7M)變性聚丙烯酰胺 (15%)凝膠；當底物為ssDNA時，建議電泳條件為180V，50-60min；當底物為ssRNA時，建議電泳條件為50-60V，20-30min；若上樣前用電泳液沖洗上樣孔中的尿素，會得到更理想的電泳條帶。
e.放大體系在65℃水浴鍋中進行反應時，反應進行1h或更長時間時，會明顯觀察到有白色沉淀出現，這是Adenylase沉淀所致，這時通常底物已反應完全，所以酶的析出不會對產物的得率產生顯著影響。
