本Protein A Agarose (Fast Flow, for IP)主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗體的純化。

Protein A是一種發(fā)現(xiàn)于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細(xì)胞壁表面蛋白，分子量為42kDa；Protein G是C型或G型鏈球菌(Streptococcal bacteria)表達(dá)的免疫球蛋白結(jié)合蛋白。Protein A和Protein G功能相似，能特異性地與哺乳動(dòng)物免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)結(jié)合，結(jié)合的部位通常為免疫球蛋白的Fc區(qū)，但有資料顯示Protein A也會(huì)和人VH3家族的Fab區(qū)結(jié)合，而Protein G有時(shí)與Fab區(qū)也有一定結(jié)合。同時(shí)，兩者對(duì)于不同的免疫球蛋白亞類的結(jié)合能力有所不同。適當(dāng)重組改造的Protein A、G與瓊脂糖凝膠(agarose)以一定的方式結(jié)合，可用于免疫沉淀或抗體的純化。
Protein A Agarose適合于免疫沉淀human IgG1、IgG2、IgG4，mouse IgG2a、IgG2b及rabbit IgG等。下表是Protein A、Protein G、Protein A+G Agarose產(chǎn)品與人、小鼠、大鼠常見的免疫球蛋白亞類的結(jié)合能力及不同物種的總結(jié)合能力情況表。
Species
Ig
Protein A
Protein G
A+G
Human
IgG1
++++
++++
++++
IgG2
++++
++++
++++
IgG3
-
++++
++++
IgG4
++++
++++
++++
IgA
++
-
++
IgD
++
-
++
IgE
++
-
++
IgM
++
-
++
Mouse
IgG1
+
++++
++++
IgG2a
++++
++++
++++
IgG2b
+++
+++
+++
IgG3
++
+++
+++
IgM
+/-
-
+/-
Rat
IgG1
-
+
+
IgG2a
-
++++
++++
IgG2b
-
++
++
IgG2c
+
++
++
IgM
+/-
-
+/-
Total Ig
Protein A
Protein G
A+G
Human
++++
++++
++++
Mouse
+++
+++
+++
Rat
+/-
++
++
Rabbit
++++
+++
++++
Goat
-
++
++
Chicken
-
+
+
Cow
++
++++
++++
Guinea Pig
++++
++
++++
Hamster
+
++
++
Horse
++
++++
++++
Pig
+++
+++
+++
Sheep
+/-
++
++
++++: Strong Binding
++~+++: Medium Binding
+: Weak Binding
+/-: Weak or No Binding
-: No Binding
 
本產(chǎn)品中的重組Protein A可與多數(shù)哺乳動(dòng)物IgG的Fc端特異性結(jié)合，分子量為14kDa。該重組Protein A經(jīng)過基因工程技術(shù)的改造，使其成為耐堿結(jié)構(gòu)域，從而實(shí)現(xiàn)Protein A的耐堿特性，并僅保留了與IgG Fc端結(jié)合相關(guān)的氨基酸序列，去除了結(jié)合位點(diǎn)以外可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合的序列，從而可以有效減少非特異性結(jié)合。每個(gè)Protein A分子可以結(jié)合2個(gè)IgG分子。
本產(chǎn)品中的Protein A共價(jià)連接到4%的高交聯(lián)度、高流速瓊脂糖(cross-linked, 4% Agarose, Fast Flow)上。每毫升Protein A agarose beads (沉淀物)中共偶聯(lián)有約20mg的重組Protein A。每毫升Protein A agarose beads (沉淀物)可以結(jié)合超過30 human IgG。Protein A脫落值極低，純化的每毫克IgG中脫落的Protein A含量低于15ng。本產(chǎn)品中agarose beads的平均直徑為90μm，抗體純化時(shí)的推薦線性流速為50-300cm/h，耐壓指數(shù)最高為0.3MPa。工作pH值范圍為3-12，可耐受0.1-0.5M的NaOH。
本產(chǎn)品配制在可以直接用于免疫沉淀和抗體純化的適當(dāng)溶液中，每毫升中共含有0.25ml agarose beads (沉淀物)。
本Protein A Agarose (Fast Flow, for IP)如果用于常規(guī)的免疫沉淀，每毫升本產(chǎn)品(沉淀和溶液為1:3的混合物)可以免疫沉淀50次。
包裝清單：
產(chǎn)品編號(hào)
產(chǎn)品名稱
包裝
P2051-2ml
Protein A Agarose (Fast Flow, for IP)
2ml
P2051-10ml
Protein A Agarose (Fast Flow, for IP)
10ml
P2051-50ml
Protein A Agarose (Fast Flow, for IP)
50ml
—
說明書
1份
 
保存條件：
4℃保存，一年有效。請(qǐng)勿冷凍。
注意事項(xiàng)：
請(qǐng)勿冷凍保存本產(chǎn)品。
Protein A Agarose使用前一定要充分重懸，即充分顛倒若干次使混合均勻。
本產(chǎn)品含有微量的防腐劑，不會(huì)影響常規(guī)的免疫沉淀和抗體純化。但如果后續(xù)涉及酶活性測(cè)定，使用本產(chǎn)品前宜先用TBS等適當(dāng)溶液洗滌Protein A agarose beads三次，以充分消除防腐劑可能產(chǎn)生的干擾。
從蛋白樣品收集開始，所有步驟中蛋白樣品都必須在4℃或冰上操作。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：
a. 蛋白樣品的準(zhǔn)備：
(a) 對(duì)于10厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，然后加入500微升至2毫升細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。可以使用生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)或各種RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等進(jìn)行細(xì)胞的裂解。
(b) 對(duì)于組織樣品參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解。
(c) 對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行裂解。
注：詳細(xì)的裂解方法參考不同裂解液的詳細(xì)使用方法。對(duì)于不同的培養(yǎng)器材，參考10厘米培養(yǎng)皿的裂解液的用量進(jìn)行裂解。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高，可以用裂解液或PBS適當(dāng)稀釋，如果蛋白樣品濃度過低，在以后的裂解過程中宜適當(dāng)減少裂解液的用量。
b. 去除非特異性結(jié)合(可選做)：
(a) 取200微升至1毫升蛋白樣品，蛋白量約為200微克至1毫克，加入約1微克和免疫沉淀時(shí)使用的IgG種屬相同的普通IgG和20微升充分重懸的Protein A Agarose，4℃緩慢搖動(dòng)30分鐘至2小時(shí)。
(b) 2500rpm(約1000g)離心5分鐘，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。
注：所謂種屬相同的IgG是指，例如后續(xù)免疫沉淀時(shí)用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG，如無normal IgG，可以加入其它不影響后續(xù)檢測(cè)的其它mouse IgG類型的抗體。通過和normal IgG和Protein A Agarose的孵育，可以充分降低非特異性的結(jié)合，降低背景。
c. 免疫沉淀：
(a) 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃緩慢搖動(dòng)過夜。
(b) 再加入20微升充分重懸的Protein A Agarose，4℃緩慢搖動(dòng)1-3個(gè)小時(shí)(為方便后續(xù)的洗滌操作，可以把加入充分重懸的Protein A Agarose的量調(diào)整為40微升)。
(c) 2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時(shí)高速離心，小心吸除上清，注意寧可留下少量上清也不能吸掉Protein A Agarose。
(d) 用準(zhǔn)備蛋白樣品時(shí)的裂解液或PBS洗滌沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1毫升。洗滌時(shí)離心條件和吸除上清的要求同上面的步驟(c)。
(e) 完成最后一次洗滌后，去除上清，加入20-40微升1X SDS-PAGE電泳上樣緩沖液Vortex重懸沉淀，瞬時(shí)高速離心把樣品離心至管底。
(f) 100℃或沸水浴處理3-5分鐘，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳，暫時(shí)不用的樣品可以-20℃保存。
2. 免疫共沉淀：
參考免疫沉淀的方法進(jìn)行，但免疫共沉淀(Co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳。
3. 抗體純化：
a. 準(zhǔn)備工作：
(a) 用0.45微米或0.2微米孔徑的濾膜過濾所用的溶液。
(b) 所有的溶液必須用超聲等方法脫氣(degas)。
(c) 選擇適當(dāng)?shù)募兓�柱，用適當(dāng)量的Protein A Agarose裝填純化柱。也可使用的預(yù)裝柱產(chǎn)品(P2024、P2025)。
(d) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌并平衡純化柱，流速可以用恒流泵控制為1ml/min (1ml預(yù)裝柱)。如無恒流泵，也可以完全依靠重力洗滌并平衡純化柱。
b. 抗體純化：
(a) 把含有待純化的抗體上樣到純化柱。
(b) 待純化的抗體過柱后，用10-20倍柱體積的TBS洗滌，以去除未結(jié)合和非特異性結(jié)合的蛋白。洗滌是否完全可以通過測(cè)定280nm的吸光度進(jìn)行確定。
(c) 洗滌完后，用10ml 50mM glycine，pH2.7作為洗脫液，洗脫結(jié)合的抗體。某些抗體和Protein A的結(jié)合能力很強(qiáng)，在pH2.7時(shí)洗脫效果不太理想，可以使用50mM glycine，pH1.9作為洗脫液。分管收集洗脫下的抗體，根據(jù)蛋白濃度或后續(xù)的檢測(cè)效果確定洗脫峰在哪幾個(gè)收集管中。
c. 純化柱的再生：
(a) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌純化柱，使純化柱達(dá)到中性的pH。
(b) 用TBS來保存再生的純化柱。