本Protein G Agarose (Fast Flow, for IP)主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗體的純化。

Protein A是一種發現于金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細胞壁表面蛋白，分子量為42kDa；Protein G是C型或G型鏈球菌(Streptococcal bacteria)表達的免疫球蛋白結合蛋白。Protein A和Protein G功能相似，能特異性地與哺乳動物免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)結合，結合的部位通常為免疫球蛋白的Fc區，但有資料顯示Protein A也會和人VH3家族的Fab區結合，而Protein G有時與Fab區也有一定結合。同時，兩者對于不同的免疫球蛋白亞類的結合能力有所不同。適當重組改造的Protein A、G與瓊脂糖凝膠(agarose)以一定的方式結合，可用于免疫沉淀或抗體的純化。
Protein G Agarose適合于免疫沉淀human IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，rat IgG1、IgG2a、IgG2b、 IgG2c，以及rabbit、goat多克隆抗體。下表是Protein A、Protein G、Protein A+G Agarose產品與人、小鼠、大鼠常見的免疫球蛋白亞類的結合能力及不同物種的總結合能力情況表。
Species
Ig
Protein A
Protein G
A+G
Human
IgG1
++++
++++
++++
IgG2
++++
++++
++++
IgG3
-
++++
++++
IgG4
++++
++++
++++
IgA
++
-
++
IgD
++
-
++
IgE
++
-
++
IgM
++
-
++
Mouse
IgG1
+
++++
++++
IgG2a
++++
++++
++++
IgG2b
+++
+++
+++
IgG3
++
+++
+++
IgM
+/-
-
+/-
Rat
IgG1
-
+
+
IgG2a
-
++++
++++
IgG2b
-
++
++
IgG2c
+
++
++
IgM
+/-
-
+/-
Total Ig
Protein A
Protein G
A+G
Human
++++
++++
++++
Mouse
+++
+++
+++
Rat
+/-
++
++
Rabbit
++++
+++
++++
Goat
-
++
++
Chicken
-
+
+
Cow
++
++++
++++
Guinea Pig
++++
++
++++
Hamster
+
++
++
Horse
++
++++
++++
Pig
+++
+++
+++
Sheep
+/-
++
++
++++: Strong Binding
++~+++: Medium Binding
+: Weak Binding
+/-: Weak or No Binding
-: No Binding
 
本產品中的重組Protein G可與多數哺乳動物IgG的Fc端特異性結合，分子量為22kDa。該重組Protein G通過改造，僅保留了與IgG Fc端結合相關的氨基酸序列，去除了結合位點以外可能導致非特異性結合的序列(如白蛋白結合位點)，從而可以有效減少非特異性結合。每個Protein G分子可以結合3個IgG。
本產品中的Protein G共價連接到4%的高交聯度、高流速瓊脂糖(cross-linked, 4% Agarose, Fast Flow)上。每毫升Protein
G agarose beads (沉淀物)中共偶聯有約2mg的重組Protein G。每毫升Protein G agarose beads (沉淀物)可以結合超過20mg human IgG。本產品中agarose beads的平均直徑為90μm，抗體純化時的推薦線性流速為50-300cm/h，耐壓指數最高為0.3MPa。
本產品配制在可以直接用于免疫沉淀和抗體純化的適當溶液中，每毫升中共含有0.25ml agarose beads (沉淀物)。
本Protein G Agarose (Fast Flow, for IP)如果用于常規的免疫沉淀，每毫升本產品(沉淀和溶液為1:3的混合物)可以免疫沉淀50次。
包裝清單：
產品編號
產品名稱
包裝
P2053-2ml
Protein G Agarose (Fast Flow, for IP)
2ml
P2053-10ml
Protein G Agarose (Fast Flow, for IP)
10ml
P2053-50ml
Protein G Agarose (Fast Flow, for IP)
50ml
—
說明書
1份
 
保存條件：
4℃保存，一年有效。請勿冷凍。
注意事項：
請勿冷凍保存本產品。
Protein G Agarose使用前一定要充分重懸，即充分顛倒若干次使混合均勻。
本產品中含有微量防腐劑，不會影響常規的免疫沉淀和抗體純化。但如果后續涉及酶活性測定，使用本產品前宜先用TBS等適當溶液洗滌Protein G Agarose beads三次，以充分消除防腐劑可能產生的干擾。
從蛋白樣品收集開始，所有步驟中蛋白樣品都必須在4℃或冰上操作。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：
a. 蛋白樣品的準備：
(a) 對于10厘米細胞培養皿中的貼壁細胞，吸除細胞培養液，PBS洗滌一次，然后加入500微升至2毫升細胞裂解液裂解細胞。可以使用生產的Western及IP細胞裂解液(P0013)或各種RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等進行細胞的裂解。
(b) 對于組織樣品參考貼壁細胞使用裂解液的比例進行裂解。
(c) 對于懸浮細胞，離心收集細胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細胞的裂解方法進行裂解。
注：詳細的裂解方法參考不同裂解液的詳細使用方法。對于不同的培養器材，參考10厘米培養皿的裂解液的用量進行裂解。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高，可以用裂解液或PBS適當稀釋，如果蛋白樣品濃度過低，在以后的裂解過程中宜適當減少裂解液的用量。
b. 去除非特異性結合(可選做)：
(a) 取200微升至1毫升蛋白樣品，蛋白量約為200微克至1毫克，加入約1微克和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG和20微升充分重懸的Protein G Agarose，4℃緩慢搖動30分鐘至2小時。
(b) 2500rpm(約1000g)離心5分鐘，取上清用于后續的免疫沉淀。
注：所謂種屬相同的IgG是指，例如后續免疫沉淀時用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG，如無normal IgG，可以加入其它不影響后續檢測的其它mouse IgG類型的抗體。通過和normal IgG和Protein G Agarose的孵育，可以充分降低非特異性的結合，降低背景。
c. 免疫沉淀：
(a) 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃緩慢搖動過夜。
(b) 再加入20微升充分重懸的Protein G Agarose，4℃緩慢搖動1-3個小時(為方便后續的洗滌操作，可以把加入充分重懸的Protein G Agarose的量調整為40微升)。
(c) 2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時高速離心，小心吸除上清，注意寧可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。
(d) 用準備蛋白樣品時的裂解液或PBS洗滌沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1毫升。洗滌時離心條件和吸除上清的要求同上面的步驟(c)。
(e) 完成最后一次洗滌后，去除上清，加入20-40微升1X SDS-PAGE電泳上樣緩沖液Vortex重懸沉淀，瞬時高速離心把樣品離心至管底。
(f) 100℃或沸水浴處理3-5分鐘，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳，暫時不用的樣品可以-20℃保存。
2. 免疫共沉淀：
參考免疫沉淀的方法進行，但免疫共沉淀(Co-IP)通常必須使用未經凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳。
3. 抗體純化：
a. 準備工作：
(a) 用0.45微米或0.2微米孔徑的濾膜過濾所用的溶液。
(b) 所有的溶液必須用超聲等方法脫氣(degas)。
(c) 選擇適當的純化柱，用適當量的Protein G Agarose裝填純化柱。也可使用預裝柱產品(P2026、P2027)。
(d) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌并平衡純化柱，流速可以用恒流泵控制為1ml/min (1ml預裝柱)。如無恒流泵，也可以完全依靠重力洗滌并平衡純化柱。
b. 抗體純化：
(a) 把含有待純化的抗體上樣到純化柱。
(b) 待純化的抗體過柱后，用10-20倍柱體積的TBS洗滌，以去除未結合和非特異性結合的蛋白。洗滌是否完全可以通過測定280nm的吸光度進行確定。
(c) 洗滌完后，用10ml 50mM glycine，pH2.7作為洗脫液，洗脫結合的抗體。某些抗體和Protein G的結合能力很強，在pH2.7時洗脫效果不太理想，可以使用50mM glycine，pH1.9作為洗脫液。分管收集洗脫下的抗體，根據蛋白濃度或后續的檢測效果確定洗脫峰在哪幾個收集管中。
c. 純化柱的再生：
(a) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌純化柱，使純化柱達到中性的pH。
(b) 用TBS來保存再生的純化柱。