線粒體DNA(mtDNA)是進行分子進化研究和母性遺傳研究的重要材料,但傳統的兩步式mtDNA提取方法是先溫和裂解細胞,分離線粒體,然后再從線粒體中提取mtDNA。此方法中的溫和裂解細胞的條件十分難以控制,需要針對不同組織材料單獨進行優化。本方法克服了上述缺點,具有下列優點:
1. 不需要單獨純化線粒體,柱式法純化,操作簡單快捷。
2. 得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。
3. 每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5
μg mtDNA。
4. 注意:本產品只適合于動物材料,不適合于植物材料。
使用及效果
在107個細胞或1克剪碎的組織中加入0.25 mL溶液A,吹打分散,再加入0.25 mL溶液B,混勻后冰浴8分鐘,加入0.35 mL溶液C后混勻,12000 g離心10分鐘,將上清液轉移到離心吸附柱中,離心1分鐘,用0.5 mL 的通用洗柱液洗兩次,最后用30-50 μL DNA洗脫液將mtDNA洗脫。
用本產品從新鮮豬肝中提取mtDNA,原液稀釋10000 倍后取10 μL做為PCR 模板, 分別用三對豬線粒體DNA專一性引物進行擴增, 用其中的1/2上樣電泳。電泳染料為綠如藍。
線粒體是合成ATP和脂肪酸的細胞器,每個細胞有多個線粒體,每個線粒體有多個基因組,例如每個釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞里有20多個線粒體,人淋巴細胞有數個,肝細 胞有500-2500個,卵母細胞有上千個。除少數低等真核生物線粒體基因組為線狀DNA外,其他生物的線粒體基因組都是環狀DNA。線粒體基因組缺乏組蛋白,故無核小體。哺乳動物的線粒體基因DNA沒有內含子,幾乎每一對核苷酸都參與一個基因的組成,有許多基因的序列是重疊的。不同物種的線粒體基因組的大小相差懸殊,在動物中的趨勢是物種越高等,mtDNA越小,排列越緊密。下表是常見物種mtDNA的大小列表
人mtDNA只有D環區(D-loop,參與復制啟動)和另外87個bp不是編碼基因外,其余序列共編碼13個蛋白質(細胞色素b、細胞色素氧化酶的3個亞基、ATP酶的2個亞基以及NADH 脫氫酶的7個亞基)、24個rRNA(包括1個16SrRNA、1個12SrRNA和22個tRNA)。人類 的神經肌肉變性疾病如Leber氏遺傳性視神經病、帕金森病、早老癡呆癥、線粒體腦肌病、母系遺傳的糖尿病和耳聾等都同線粒體基因有關。
高等植物mtDNA長度在100 Kb~2000 Kb之間,大部分由非編碼的DNA序列組成,且有許多短的同源序列,同源序列之間的DNA重組會產生較小的亞基因組環狀DNA,與完整的“主”基因 組共存于細胞內,因此植物線粒體基因組的研究更為困難。
與細胞核DNA相比,mtDNA具有下列特點:①突變率高,是核DNA的10-100倍左右, 有利于檢查出在較短時期內基因發生的變化,有利于比較不同物種的相同基因之間的差別,確定這些物種在進化上的親緣關系;②母性遺傳(maternal inheritance),這是由于動物精子的細胞質極少,子代mtDNA基本上都是來自卵細胞,因此具有相同mtDNA序列的個體必定是來自一位共同的雌性祖先。