CAT#:81107-50
常溫運輸和保存 (部分低溫)
大提無內毒素質粒 DNAOUT Endo-free Max Column Plasmid DNAout
使用手冊 V1.5
| 產品及特點 | 本試劑盒采用改進 SDS-堿裂解法裂解細胞，通過獨特的內毒素清除劑選擇性結 合離心除去內毒素，然后離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低 pH 值狀態下選擇性地 結合溶液中的質粒 DNA ，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除 ，最 后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質粒 DNA 從硅基質膜上洗脫 。操作簡單 ，只 在經典的柱式質粒 DNA 提取前 ，增加菌體內毒素清除一步。 1. 離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附 量差異極小 ，可重復性好 。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。 2. 獨特工藝配方清除內毒素 ， 內毒素含量極低 (<0. 1 EU/μg DNA) ，細胞轉染效 果極佳 。也可直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序、等各種分子生物學 實驗。 | |||||
| 規格及成分 | 試劑盒組成、儲存、穩定性： | |||||
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| 成 份 | 保存 | 編 號 | 大紙盒包裝 |
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| 平衡液 | 室溫 | 90901 | 5ml | |||
| RNase A (10mg/ml) | -20℃ | 60205a | 150µl | |||
| 溶液 P1 | 4℃ | 60205b | 15 ml | |||
| 溶液 P2 | 室溫 | 60205c | 15 ml | |||
| 溶液 N3 | 室溫 | 3160 | 15 ml | |||
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去蛋白液 PE |
室溫 | 90303 | 16 ml 第一次使用前按說明 加指定量乙醇 | |||
| 內毒素清除劑 | -20℃ | 60408 | 5 ml | |||
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漂洗液 WB |
室溫 | 1 1 1205 | 13 ml 第一次使用前按說明 加指定量乙醇 | |||
| 洗脫緩沖液 EB | 室溫 | 1 1 1206 | 15 ml | |||
| 吸附柱 AC | 室溫 | 1 1 1207 | 50 個 | |||
| 收集管 (2ml) | 室溫 | 1 1 1208 | 50 個 | |||
| 使用手冊 |
| 81107sc | 1 份 | |||
| 運輸及保存 | 本試劑盒在室溫儲存 12 個月不影響使用效果。 內毒素清除劑常溫運輸 ， 4 度可以保存一個月 ，長期保存放-20℃。 儲存事項： 1. RNaseA 保存在即用型甘油緩沖液中 ，常溫運輸 ，收到后 ，不超過 25℃室溫至 少保存 6 個月 ， 4 ℃保存 12 個月 ，長期保存放－20℃。 2. 第 一 次 使 用 時 ， 將 試 劑 盒 所 帶 的 全 部 RNase A 加 入 溶 液 P1 后 (終 濃 度 100ug/ml) 置于 2-8 ℃保存 。如果溶液 P1 中 RNase A 失活 ，提取的質粒可 能會有微量 RNA 殘留 ，在溶液 P1 中補加 RNase A 即可。 | |||||
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| 3. 環境溫度低時溶液 P2 中 SDS 可能會析出渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾 |
| 分鐘 ， 即可恢復澄清 ，不要劇烈搖晃 ， 以免形成過量的泡沫。 | |
| 4. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH 值變化 ，各溶液使用后應及 | |
| 時蓋緊蓋子。 | |
| 使用方法 | 操作步驟： (實驗前請先閱讀注意事項) 提示：
入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇 ， 以免多次加入!
1. 取 1.5-4.5 ml 過夜培養的菌液 ， 12,000 rpm 離心 30 秒 ，盡可能的倒干上清， 收集菌體。 收集超過 1.5 ml 菌液 ， 可以離心棄上清后 ，在同一個 1.5ml 管內加入更多的 菌液 ，重復步驟 1 ，直到收集到足夠的菌體。 2. 用 250μl 溶液 P1 重懸菌體沉淀 ，渦旋振蕩至徹底懸浮。 如果有未徹底混勻的菌塊 ，會影響裂解 ，導致提取量和純度偏低。 3. 加 250μl 的溶液 P2 ，溫和地上下翻轉 6 -8 次使菌體充分裂解 ，室溫放置 4 分 鐘。 溫和地混合 ，不要劇烈震蕩 ， 以免基因組 DNA 剪切斷裂！ 所用時間不應超過 5 分鐘！以免質粒受到破壞 。此時菌液應變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘 稠后就可以做下一步 ，不是一定要準確的 5 分鐘。 4. 加 250μl 溶液 N3 ，立即溫和地上下翻轉 6 -8 次 ，充分混勻時會出現白色絮狀 沉淀 。 12,000 rpm 離心 10 分鐘 ，小心取上清至新管 ，避免吸取到漂浮白色沉 淀。 加入溶液 N3 后應該立即混勻 ， 以免產生 SDS 的局部沉淀。 5. 加入 0. 1 體積(上清的體積的 10%，約 80µl)的內毒素清除劑到上一步所得上清， 顛倒旋轉混勻，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷凍室)放置 5 分鐘直到渾濁變清亮 透明 (或仍舊稍有渾濁) ， 中間偶爾混勻幾次。 內毒素清除劑加入上清后，上清會變得渾濁，但是冰浴后應恢復清亮(或稍渾濁) 。 6. 常溫放置 3-5 分鐘 ，溫度恢復室溫溶液很快變為渾濁 ，顛倒混勻。 如室內溫度較低或者想加快速度可以在 37-42℃水浴 ，將很快變渾濁 ，顛倒混 勻。 7. 室溫 12,000 rpm 離心 10 分鐘分相 。 上層水相含 DNA ， 下層藍色油狀相含 內毒素和其它雜質 。將含 DNA 的上層水相轉移到新管 (注意不要吸到藍色油狀 層 ，里面含內毒素等雜質) ，棄油狀層。 平衡液預處理吸附柱： 使用平衡液預處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見前文“關于平衡液的 使用” 8. 向上層水相中加入 0.5 體積異丙醇 (約 370µl) 后充分顛倒混勻后分兩次 (每 次不超過 700µl) 轉入吸附柱 AC 中 (吸附柱放入收集管中) ， 12,000 rpm 離 心 1 分鐘 ，倒掉收集管中的廢液 。直到所有混合溶液通過此吸附柱。 9. 加入 500μl 去蛋白液 PE ， 12,000 rpm 離心 30 秒 ，棄廢液。 此步驟為了去除痕量核酸酶等雜質 ，如所用菌株為 JM 系列、 HB101 等 endA 菌株或野生型菌株 ，核酸酶含量豐富 ，應加此步驟； 如所用菌株為 XL- 1 Blue、 Top10 和 DH5α等缺陷型菌株 ，核酸酶含量低 ，則可略過此步驟。 10. 加入 600μl 漂洗液 WB (請先檢查是否已加入無水乙醇!) ， 12,000 rpm 離心 30 秒 ，棄掉廢液 。再加入 600μl 漂洗液 WB ，重復漂洗一次。 |
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| 1 1. 將吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000 rpm 離心 2 分鐘，盡量除去漂洗液 ， 以 免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。 12. 取出吸附柱 AC ，放入一個干凈的離心管中 ，在吸附膜的中間部位加 50- 100μl 洗脫緩沖液 EB (洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好) ，室溫放置 2 分鐘 ， 12,000 rpm 離心 1 分鐘 。如果需要較多量質粒 ，可將得到的溶液重 新加入離心吸附柱中 ，室溫放置 2 分鐘 ，離心 1 分鐘。 洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要質粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于 30μl ，體積過小降低質粒洗脫效率 ，減少質粒產量。 |
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注意事項 | 1. 所有的離心步驟均在室溫完成 ，使用轉速可以達到 13,000rpm 的傳 統臺式離心機 ，如 Eppendorf 5415C 或者類似離心機。 2. 提取質粒的量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關 。一般高拷貝 質粒，建議接種單菌落于 1.5-4.5 ml 加合適抗生素的 LB 培養基 ， 過 夜培養 14- 16 個小時 ，可提取出多達 20µg-50µg 的純凈質粒 。如果 所提質粒為低拷貝質粒或大于 10kb 的大質粒 ，應適當加大菌體使用 量，使用 5- 10 ml 過夜培養物，同時按比例增加 P1、P2、N3 的用量， 其它步驟相同。 3. 得到的質粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與 純度 。 OD260 值為 1 相當于大約 50μg/ml DNA 。 電泳可能為單一 條帶 ，也可能為 2 條或者多條 DNA 條帶 ，這主要是不同程度的超螺 旋構象質粒泳動位置不一造成 ，與提取物培養時間長短、提取時操作 劇烈程度等有關 。 本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 90%。 4. 質粒 DNA 確切分子大小 ， 必須酶切線性化后 ， 對比 DNA 分子量 Marker 才可以知道 。 處于環狀或者超螺旋狀態的的質粒 ， 泳動位置 不確定 ，無法通過電泳知道其確切大小。 5. 洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA ，不影響下游酶切、連接等反應 。也 可以使用水洗脫 ，但應該確保 pH 大于 7.5 ，pH 過低影響洗脫效率。 用水洗脫質粒應該保存在－ 20℃ 。質粒 DNA 如果需要長期保存 ，可 以用 TE 緩沖液洗脫 ( 10mM Tris-HCl ， 1mM EDTA ，pH 8.0) ， 但是 EDTA 可能影響下游酶切反應 ，使用時可以適當稀釋。 關于平衡液的使用 介紹 ：核酸吸附硅膠膜柱子長期放置過程中會同空氣中的電荷/塵 埃發生反應而影響其核酸的結合能力 。硅膠柱經平衡液預處理后可大大減 少柱子中硅膠膜的憎水基團 ，提高核酸的結合能力 。從而提高硅膠柱子回 收效率或者產量 。平衡液是強堿性溶液 ，若不小心碰到 ，請用大量自來水 清洗 。 用完后需蓋緊瓶蓋 ， 以免接觸空氣 。 室溫保存 。在保存過程中可能 有沉淀生成 ，請加熱至 37℃使沉淀完全消失。 使用方法：取一個新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中 ，吸取 100μl 的平衡液至柱子中 。 12,000 rpm 離心 1 分鐘 ，倒掉收集管中廢液 ，將吸 附柱子重新放回收集管。此時平衡液預處理柱子完畢。接后續的操作步驟。 |
| 關聯產品 | 無內毒素質粒 DNAOUT |
20180330dx
