EB分子中的錠是由一個苯基和一個三環菲錠環構成，苯基可以繞三環菲錠環旋轉，而三環菲錠環是一個整體，呈扁 平狀，十分類似于DNA結構中的AT堿基配對，故能以與DNA螺旋軸線垂直的方式嵌入到DNA堿基對之間。其結合力是范德華力和堿基相堆積力，其外圍的苯基和乙基基團還能扣在DNA的大溝上，使結合更加穩定。插入DNA后錠與水脫離，而水是熒光淬滅劑，所以在DNA中錠的熒光強度恢復，熒光產率比溶液中游離錠的熒光產率高20-30倍。EB的熒光 需要波長為254 nm、302 nm或366 nm的激發光激發，但作用原理各不相同。254 nm的紫外輻射能量是先由DNA吸收（核酸在260 nm左右的光吸收特性）再將其傳遞給EB分子，302 nm和366 nm的紫外輻射能量是靠EB分子自身吸收。EB分子所得到能量在590 nm的橙紅色光譜區以0.3的量子產率重新發射出來，所以DNA-EB復合物呈紅色。由于254 nm紫外光對DNA的損傷較強，而在366 nm紫外光下EB產生的熒光又較弱，所以人們一般使用302 nm的紫外光來觀察EB染色后的核酸。
EB與DNA的結合幾乎沒有堿基序列特異性，在高離子強度的飽和溶液中，大約每2.5個堿基插入一個EB分子，此時 的DNA長度將增加27%。EB還可以結合到單鏈DNA或RNA分子內形成的較短的鏈內螺旋上，所以也可以檢測單鏈DNA 或RNA，但是EB對單鏈核酸的親和力相對較小，靈敏度較低。在凝膠中有EB存在的情況下，DNA的電泳遷移率會降低15%左右。
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