植物原生質體制備及轉化試劑盒

產品簡介：

植物原生質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生命活力的裸露細胞。它具有細胞生命特征和全能型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物遺傳工程的理想受體 和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細胞壁成分，去除細胞壁，即可得到原生質體。許多方法可誘導原生質體融合，現在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇 (PEG) 法。聚乙二醇 (PEG)作為一種高分子化合物，合適的濃度能對原生質體產生瞬間沖擊效應，原生質體很快發生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進行清洗，使原生質體 融合得以完成。

按照每次使用5 ml酶消化體系計算，本試劑盒可用于40次酶消化反應。本試劑盒每個5 ml反應 體系可處理0.1 g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片),操作較好的情況下每5 ml 體系可獲得約50-70 萬個原生質體(不同植物不同操作會有一定的差異),可滿足約25-70個樣品的原生質體質粒轉染操 作(按照每樣1-2萬個細胞計算)。原生質體轉化時，按照每次轉化100 μl原生質體溶液，轉化試劑可以完成至少40個樣品的轉化。

試劑盒組成：

貯存和運輸：

-20℃保存，至少一年有效。

組分4℃存放3-5天不會影響使用效果，長期不用則需按照標簽溫度貯存。

試劑盒冷藏運輸。

使用說明：

需要準備的材料(試劑盒不提供):

剪尖吸頭(剪尖后可以用酒精燈過火將吸頭處理平滑);纖維素酶R-10; 離 析 酶R-10; 平頭鑷子；70 μm細胞過濾篩； 一次性刀片；50 ml離心管；1.5 ml離心管；水浴鍋。

一 、原生質體分離：

即用型酶溶液配制

注：即用型酶溶液現用現配，不建議配制后凍存后再使用； 溶解好的正常酶溶液應為澄清棕黃色溶液,如使用純度不好的酶，溶液為不溶解的乳白色懸濁液，不能使用。

1.1酶解：

取生長狀態良好的葉片切成0.5-1 mm 的小條，按照0.1 克葉片(擬南芥約15-20個葉片)加5 ml  即用型酶溶液的比例迅速將切割好的葉片小條浸泡于酶溶液中，避光，無需震蕩，常溫(20-25℃) 酶解3小時，間歇混勻。

注：酶解時間與葉片種類，葉片生長狀態有關，請根據實驗需要適當調整酶解時間。3小時為擬南芥葉片推薦的酶解 時間。如條件允許，可以使用微型真空泵常溫避光條件下抽真空30 min, 以使酶溶液更好地進入細胞間隙。酶溶液變 為綠色表明有原生質體已經有分離，溶液為濃綠色表明原生質體已經大量分離(左下圖)。擬南芥原生質體大小約為30-50μm,顯微鏡鏡檢后確定是否分離。葉片原生質體細胞顯微鏡下為綠色圓球狀，葉綠體分散在整個細胞內,說明狀態較好；如呈現不規則形狀，說明原生質體破碎或即將破碎。

1.2漂洗：

酶解后加入等體積的溶液IⅡ,如使用5 ml酶解體系，加入5 ml溶液Ⅱ,輕柔混勻。

1.3過濾：

用孔徑70 μm篩網(自備)過濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，用5-10 ml溶液Ⅱ沖洗酶解器 皿和未消化的葉片1-2次，將所有的液體收到50 ml離心管中。

1.4第一次收集：

濾出液100 g 常溫離心2分鐘，盡量去除上清。

注：為了避免原生質體離心時貼在管壁，建議整個實驗過程使用水平轉頭；離心時，可調低離心機的升速和降速。

升速過快，原生質體可能離到管壁上；降速過快，可能導致管底原生質體懸起。建議升速和降速分別都使用3。

1.5第二次收集：

加入2-5 ml 溶液Ⅱ,用剪尖的藍吸頭重懸原生質體，冰浴30分鐘，原生質體在重力作用下可以沉 降到離心管底部，盡量吸除上清，收集原生質體。(如果發現原生質體沉降的速度比較慢或者得 率比較低，也可以考慮常溫100 g 離心1-2 min收集原生質體)。

1.6重懸：

小心去除上清溶液，不要觸動原生質體沉淀，沉淀用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液Ⅲ中即為原生 質體溶液。(可以用血球計數板計數，根據原生質體數量調整溶液Ⅲ的加入體積，使得原生質體 密度為2×105/ml或更高)。

注：制備好的原生質體可以在4℃或冰浴保存至少24 h。

二 、原生質體轉化和培養：

2.1轉化溶液配制：

植物原生質體轉化參考下表根據樣品量配制轉化溶液。

注：轉化溶液現用現配。轉化溶液需要在轉化前至少1小時配制，以確保轉化試劑溶解充分。轉化溶液配制后盡量 當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之內仍然有較好的轉化效率，但和當天配制的轉化溶液相比，轉化效果 可能會有一定程度的下降。

2.2準備質粒：

取10 μl 質粒DNA(10-20   μg,濃度為1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。

 注：質粒大小建議為5-10 kb, 質粒濃度為1-2 μg/μl左右；

原生質體轉化對于質粒的純度要求較高，盡量使用高純度的質粒。

2.3質粒轉化：

2.3.1質粒管中加入100 μl原生質體溶液(原生質體密度為2×105/ml,約2萬個原生質體),輕柔混勻。

2.3.2加入等體積即110 μl 步驟1事先準備好的轉化溶液，輕彈管底，混勻，常溫25℃放置5-15分鐘。 注：最長可以孵育15 min, 但通常孵育5 min 時間已經足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生質體和不同的質粒需 要通過實驗摸索。

2.4終止轉化：

加入2倍體積即440 μl溶液Ⅱ,輕柔徹底混勻，終止轉化過程。

2.5收集原生質體：

常溫100 g 離心1-2分鐘，盡量去除上清。

注：由于轉化后的溶液會非常粘稠，加入溶液II后離心1 min 通常可以使原生質體聚集在管底，但使用某些突變體時 為減少原生質體損失，可將離心時間延長到2 min。

2.6原生質體漂洗：

加入500 μl溶液IⅡ輕輕重懸原生質體，常溫100g離心1 min,  盡量去除殘留的上清。

注：本步驟可以充分去除殘留的轉化試劑溶液中的組分，避免轉化試劑溶液中的組分對于后續的不良影響。

2.7原生質體重懸：

沉淀中加入1 ml 溶液V,  輕柔重懸。

2.8原生質體培養：

將離心管水平放置，23-25℃弱光培養。

注：根據實驗需求確定孵育時間。RNA分析孵育2-6小時；酶活性分析和蛋白標記實驗孵育2-16小時；基因編輯的 效果在轉染24小時后可能被檢測到。