植物原生質體轉染試劑盒(Plant Protoplasts Transfection Kit)，可用于將質粒、Cas9/sgRNA等蛋白和RNA轉染進入植物原生質體內，經轉染的植物原生質體經過一定時間培養(yǎng)后，可用于檢測外源基因的表達和功能，或者轉染后的基因下調、基因敲除或基因編輯效果等。

對于擬南芥原生質體，使用本試劑盒轉染質粒后通常2-6小時可以檢測相關基因的轉錄變化(mRNA等RNA的變化)，通常2-16小時后可以檢測到相關蛋白表達的變化，通常24小時可以檢測到基因編輯的效果。

植物原生質體是開展一系列植物細胞研究的重要材料，可以用于如將DNA、RNA或者蛋白通過電擊法(electroporation)、顯微注射(microinjection)或聚乙二醇法介導的轉染(PEG-mediated transfection)等。本試劑盒采用的是一種優(yōu)化的聚乙二醇轉染方法，借助聚乙二醇短時間內對原生質體產生的沖擊效應，使質粒DNA、RNA或蛋白得以進入原生質體，具有使用便捷、轉染效率高等優(yōu)點。

本試劑盒可植物原生質體分離試劑盒配合使用，完成一些模式生物如擬南芥原生質體外源基因的短時間或長期表達或者內源基因的關閉、下調或編輯等。

使用本試劑盒將植物EGFP表達質粒轉染擬南芥原生質體的效果如圖1所示。圖中可見可以獲得非常高的轉染效率。

圖1. 使用植物原生質體轉染試劑盒(Plant Protoplasts Transfection Kit)轉染擬南芥原生質體的效果圖。對于使用植物原生質體分離試劑盒(C0362)獲得的擬南芥葉片原生質體，參考如下體系制備轉染試劑溶液：稱取0.48g轉染試劑于2ml離心管(FCT121)中，加入300μl溶液A、480μl溶液B，顛倒混勻，使轉染試劑充分溶解后備用(足夠用于10個后續(xù)的10個樣品的轉染)。在2ml的圓底離心管(FTUB019)中加入20μg p35SPPDK-EGFP-Flag (植物用綠色熒光蛋白) (D2627)，加入100μl制備好的原生質體，輕柔混勻后加入110μl當日配制好的轉染試劑溶液，輕柔混勻，室溫靜置5min后加入440μl終止液，輕輕顛倒混勻，室溫100g離心1min，去除上清，再加入0.5ml終止液，輕柔重懸原生質體，室溫100g離心1min后，盡量去除上清，收集原生質體。加入1ml培養(yǎng)液，小心重懸原生質體后將其平置25℃培養(yǎng)過夜(約16h)，次日于熒光顯微鏡下檢測EGFP熒光信號。上圖為實際檢測的明場和熒光照片。

一個小包裝(C0563S)的本試劑盒可以用于相當于6孔板100個孔的樣品，12孔板200個孔的樣品，或24孔板400個孔的樣品的轉染。一個中包裝(C0563M)的本試劑盒可以用于相當于6孔板500個孔的樣品，12孔板1000個孔的樣品，或24孔板2000個孔的樣品的轉染。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，一年有效。轉染試劑可以室溫或4℃保存。1-2周內多次使用可以4℃保存。

注意事項：

請按照試劑盒要求的保存條件存放相關試劑，使用時請將各溶液充分融解并混勻。

本試劑盒使用時，需要按照無菌操作要求規(guī)范進行，避免微生物污染。培養(yǎng)液可適當分裝后保存。

本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.轉染試劑溶液的配制。
對于原生質體樣品(每個樣品為2萬個原生質體)的質粒轉染，參考下表根據(jù)樣品量配制轉染試劑溶液，配制后室溫存放備用。轉染試劑溶液需要在轉染前至少1小時配制，以確保轉染試劑溶解充分。轉染試劑溶液配制后盡量當天使用。配制好的轉染試劑溶液室溫保存5天之內仍然有較好的轉染效率，但和當天配制的轉染試劑溶液相比，轉染效果可能會有一定程度的下降。

2.質粒DNA轉染：
a.取10μl質粒DNA(10-20μg)于2ml圓底離心管中。質粒大小建議為5~10kb，質粒濃度為1~2μg/μl左右。
多個質粒同時轉染時的體積和總質量保持不變。多個質粒轉染時，每種質粒的用量比例，需要酌情自行調整。質粒轉染也可以在12或24孔板中進行，轉染體系也可以按照比例放大或縮小。本試劑盒中描述的用量相當于是6孔板中的用量。原生質體用多孔板培養(yǎng)時，最好選擇未經表面處理的多孔板。對于經過表面處理的動物細胞培養(yǎng)用多孔板，可以使用5%胎牛血清或小牛血清處理孔表面數(shù)秒，這樣有助于減小孔底表面對于原生質體的損傷。
b.加入100μl濃度約為2×10⁵/ml的原生質體懸浮液(共約2萬個原生質體)，輕輕混勻。
c.加入110μl至少提前1小時配制好的轉染試劑溶液，輕輕彈擊離心管底部，以充分混勻。
d.25℃靜置孵育5min。最長可以孵育15min，但通常孵育5min時間已經足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生質體和不同的質粒需要通過實驗摸索。
e.加入440μl的終止液，輕輕混勻，25℃ 100g離心1-2min，盡量去除上清，收集原生質體。由于轉染液非常粘稠，本步驟加入終止液后離心1min通常可以使原生質體聚集在管底，但使用某些突變體時為減少原生質體損失，可將離心時間延長至2min。
f.加入500μl終止液輕輕重懸原生質體，25℃ 100g離心1min后去除上清，盡量去除殘留的上清。本步驟可以充分去除殘留的轉染試劑溶液中的組分，避免轉染試劑溶液中的組分對于后續(xù)的不良影響。
g.加入1ml培養(yǎng)液，小心重懸原生質體，隨后將離心管平置，23-25℃弱光培養(yǎng)。
h.根據(jù)具體的實驗設計，可以在轉染后2-6小時或更長時間，檢測相關的RNA，可以在轉染后2-16小時或更長時間，檢測相關的蛋白或酶活性。基因編輯的效果在轉染24小時后就可能被檢測到。
3.Cas9/sgRNA等蛋白和RNA的轉染。
a.取200μl濃度約為1×10⁶/ml的原生質體(共約20萬原生質體)懸浮溶液加至1.5ml離心管，加入3.3μl或10μl Cas9 (6μg/μl)和sgRNA (2.2μg/μl for each sgRNA)，輕輕混勻，加入200μl提前配制好的轉染試劑溶液，輕輕混勻，25℃靜置孵育5-20min。其它蛋白或RNA的轉染可以參考進行。最佳的孵育時間需要根據(jù)特定的實驗條件適當摸索。
b.加入800μl終止液，輕輕混勻，25℃ 100g離心5min，盡量去除上清，收集原生質體。
c.加入1ml終止液，輕輕重懸原生質體，25℃條件下100g離心2min后，盡量去除上清。
d.用1ml培養(yǎng)液輕輕重懸原生質體，將其平置23-25℃培養(yǎng)過夜(16-24h)。轉染24小時后就很可能檢測到基因編輯產生的插入或缺失突變(Indel)。采用其它適當?shù)呐囵B(yǎng)液對于基因編輯的效果可能更好，例如Modified KM 8p liquid medium with 400 mM glucose等。
常見問題：
1.轉染效率低。
a.轉染試劑溶液的質量對于轉染效率的影響較大。轉染試劑溶液應現(xiàn)用現(xiàn)配，不能高溫高壓滅菌，并且需要確保轉染試劑充分溶解。
b.原生質體轉染對于質粒的純度要求較高，需要盡量使用高純度的質粒。
c.由于質粒的大小會對轉染效率產生影響，可通過預實驗摸索轉染時不同大小質粒的用量與原生質體的比例。
d.原生質體質量對轉染效果影響很大，建議使用生長健康的植物如擬南芥的嫩綠葉片進行原生質體分離。通常原生質體如果在轉染和培養(yǎng)的過程中發(fā)生破碎的現(xiàn)象，會嚴重影響轉染效果。原生質體發(fā)生破碎和制備原生質體的樣品生長狀態(tài)欠佳、制備步驟出現(xiàn)問題或后續(xù)轉染時操作不當(例如和轉染試劑溶液孵育時間過長等)有關。