注 意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
AsA又稱維生素c。AsA是輔酶、自由基清除劑、電子共體/受體和草酸鹽與酒石酸鹽生物合成的底物等。作為植物細胞中最重要的抗氧化劑,AsA在保護葉綠體免于氧化損傷起著舉足輕重的作用,也是衡量農作物產品品質的重要指標之一。
測定原理:
在乙酸溶液中,抗壞血酸與固藍鹽B反應生成黃色的草酰肼–2–羥基丁酰內酯衍生物,在最大吸收波長420處測定吸光度。
自備儀器和用品:
研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計、1mL玻璃比色皿、可調式移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體60mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體4mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體6mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×2瓶(棕色),4℃避光保存。臨用前配制,每瓶加入7 mL蒸餾水充分溶解,用不完的試劑4℃下可保存3天。
1. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心20min,取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);8000g,4℃離心20min,取上清液置冰上混勻待測。
3. 血清等液體:直接測定。
AsA測定操作:
1. 分光光度計預熱30 min,調節波長到420 nm,蒸餾水調零。
2. 在EP管中加入下列試劑
試劑名稱 | 測定管 | 空白管 |
樣本 | 200 |
|
提取液 |
| 200 |
試劑一 | 60 | 60 |
試劑二 | 100 | 100 |
試劑三 | 240 | 240 |
水 | 1400 | 1400 |
混勻,25℃靜置20min,吸取1mL加入1mL玻璃比色皿中,420nm下測定各管吸光值。ΔA=A測定-A空
注意:空白管只需測定一次。