注 意:注意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
CK(EC 2.7.3.2)主要存在于心臟、肌肉以及腦等組織中,能可逆地催化肌酸與ATP之間的轉磷酰基反應,在能量運轉、肌肉收縮和ATP再生中有重要作用,是臨床診斷心腦疾病的一個重要指標。
測定原理:
CK催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP,己糖激酶催化ATP與葡萄糖形成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化6-磷酸葡萄糖與NADP+生成NADPH,導致340nm光吸收值增加。
自備實驗用品及儀器:
天平、低溫離心機、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計、1 mL石英比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體60mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:粉劑1瓶,4℃避光保存,使用前加15mL蒸餾水溶解。
試劑二:液體15mL×1瓶,4℃保存。
工作液:臨用前根據用量將試劑一和試劑二以1:1混合。使用前37℃溫育2min。
粗酶液提取:
1. 組織樣本:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿,然后10000g,4℃離心15min,取上清,置冰上待測。
2. 血清樣本:直接測定。
測定操作表:
1. 紫外分光光度計預熱30min,調節波長至340nm,蒸餾水調零。
2.在1 mL石英比色皿中加入200μL樣本和300μL蒸餾水,最后加入500μL工作液,立即混勻,37℃下測定初始吸光值A1與1min后的吸光值A2,ΔA=A2-A1。
CK活性計算公式:
1、按組織蛋白含量計算
酶活定義:37℃,pH7.0時,每毫克蛋白質1min內催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
2、按組織樣本質量計算:
酶活定義:37℃,pH7.0時,每克樣品1min內催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
3. 按血清計算:
酶活定義:37℃,pH7.0時,每升血清1min內催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
:NADPH摩爾消光系數,6220 L /mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應體系總體積,1mL;V樣:反應體系中樣本體積,0.2mL;T,反應時間,1min;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質量,g