- 介紹： 基 因 型TetrΔ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte[F´proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]
- 簡 要 說 明XL10-Gold是目前轉化效率最高的感受態細胞，由Stratagene開發的特異性用于大質粒或珍貴連接產物轉化或構建文庫的超級感受態細胞。XL10-Gold菌株為Hte(high transformation efficiency)基因型，Hte是Stratagene開發的特異性提高感受態轉化效率及大質粒轉化能力的宿主菌基因型，已成功應用于40kd質粒的構建。[Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173]賦予XL10-Gold缺失幾乎所有已知的限制酶切系統；同時缺失核酸內切酶(endA)，提高了質粒DNA的產量和質量；重組酶缺陷型(recA)減少插入片段的同源重組概率，保證了插入DNA的穩定性；Tetr， Camr賦予菌株四環素和氯霉素抗性；lacIqZΔM15的存在使XL10-Gold可用于藍、白斑篩選。 High5TM系列XL10-Gold感受態細胞經特殊工藝制作，經pUC19質粒檢測轉化效率>2×109cfu/μg。
- 操 作 說 明
- 1.0.1cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
- 2.取-80℃保存的XL10-gold電擊感受態細胞插入冰中5分鐘，待其融化，加入目的DNA(質粒或連接產物)并用手撥打 EP 管底輕輕混勻，避免產生氣泡，立即插入冰中。A.測定轉化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對照質粒 pUC19；B.對于連接產物，請用乙醇沉淀 DNA 后加入適量 TE 緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸，DNA 濃度不超過 100 ng/μl，體積不超過 5 μl/50 μl 感受態。
- 3.用 200 μl 槍頭(用刀切除 0.5cm 槍尖)將感受態-DNA 混合物快速移到電擊杯中，避免產生氣泡，蓋上杯蓋。
- 4.啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為 BioRad 電轉儀推薦參數，也可按所用 電轉儀推薦的參數操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。
- 5.立即 向電擊杯中加入1000 μl不含抗生素的無菌培養基 S.O.C.，混勻后轉移到空50ml管中，并用1ml SOC輕柔沖洗電轉杯并轉移到50ml管中，另補加3ml SOC培養基， 37℃，200 rpm復蘇60分鐘。6.5000 rpm 離心一分鐘收菌，重懸后取 100-200 μl 涂布到含相應抗生素的 S.O.C 平板上（因菌量較大， 若全部涂板請選用直徑 15cm 培養皿 2-5 個）。將平板倒置放于 37℃培養箱過夜培養過夜。
- 注 意 事 項
- 1. 加入DNA 時體積不應大于感受態體積的1/10。
- 2. 電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡，氣泡會增加弧光放電風險。
- 3. 當DNA 不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉化效率急劇下降。
- 4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導，增大在含有細胞和DNA 的溶液中產生電流和弧光放電的風險。
- 5. 若轉化大質粒或想獲得較高轉化效率，推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。
- 6. 對于連接產物轉化，最好轉化前乙醇沉淀DNA 后用適量TE 緩沖液(10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物，保證DNA 濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率，增加弧光放電的風險。
- 7. 混入質粒時應輕柔操作，吸取感受態細胞時避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細胞膜，降低轉化效率。轉化高濃度的質粒或連接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。
- 8. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。
- 儲存條件： -80℃
- 用途： 克隆感受態細胞
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